The genus Sideritis consists of approximately 150 species worldwide, most of which grow in the Mediterranean region. In Greece, there are 16 taxa of the plant most of which are known by the common name "mountain tea" and are consumed as infusions or decoctions. This particular plant has aroused research interest due to its various biological properties as well as its use as a therapeutic agent against respiratory infections and digestive disorders, since antiquity.
The interest of the present thesis lies on the species Sideritis clandestina ssp. peloponnesiaca, for which not many studies have been conducted so far, other than those concerning the composition of its essential oil and the neuroprotective effect of its infusions and extracts. This particular species is endemic to North Peloponnese, where it naturally grows. In particular, the plant material used for the purpose of this study, was collected from Mount Helmos.
The aim of this thesis was to investigate the natural products of the ethyl acetate extract from S. clandestina ssp. peloponnesiaca in terms of their structure and inhibitory activity on the enzyme acetylcholinesterase, which plays an important role in neurotransmission. Specifically, two fractions of the total extract were studied. The separation of the components of both fractions was performed by the technique of Preparative Liquid Chromatography (PLC) and High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Subsequently, the compound β-sitosterol was isolated and identified by mass spectrometry, 1H-NMR and 13C-NMR experiments, as well as by two-dimensional HSQC, HMBC, COSY, and ROESY experiments. The phenylpropanoid glycoside verbascoside was also isolated and was identified by Mass Spectrometry and 1H-NMR. Two natural product fractions were further isolated, one of which is a mixture of two phenylpropanoid glycosides and the second one is a mixture of 6 compounds that include phenylpropanoid glycosides and glycosylated flavonoid derivatives. Their components were identified using the UPLC-ESI / MS technique.
Furthermore, the inhibitory activity of beta-sitosterol and of the two isolated mixtures on eel acetylcholinesterase and on human serum butyrylcholinesterase was examined, using the Ellman’s method. All three samples demonstrated low to moderate inhibition on both enzymes. Specifically, the mixture of the 6 phenolic compounds demonstrated the highest inhibition (37.44% at the concentration of 45.45 μg/mL on eeAChE, 46.81% at 50 μg/mL on BuChE), followed by the mixture of the 2 phenylpropanoids which demonstrated moderate activity (19.39% on eeAChE and 26.96% on BuChE, at the same concentrations) and finally, β-sitosterol which demonstrated low to moderate activity on both the enzymes (28.35% at 113.64 μg/mL on eeAChE, 18.16% at 125 μg/mL on BuChE).
Το γένος Sideritis περιλαμβάνει περίπου 150 είδη ανά τον κόσμο, εκ των οποίων τα περισσότερα φύονται στην περιοχή της Μεσογείου. Στην Ελλάδα, εντοπίζονται 16 taxa του φυτού, η πλειοψηφία των οποίων είναι γνωστά με το κοινό όνομα «τσάι του βουνού» και καταναλώνονται ως αφεψήματα ή εγχύματα. Το συγκεκριμένο φυτό έχει κεντρίσει το ερευνητικό ενδιαφέρον λόγω των ποικίλων βιολογικών ιδιοτήτων του καθώς και λόγω της χρήσης του ως θεραπευτικό μέσο κατά των λοιμώξεων του αναπνευστικού και των διαταραχών του πεπτικού, ήδη από την αρχαιότητα.
Στην παρούσα διπλωματική εργασία, μελετήθηκε το είδος Sideritis clandestina ssp. peloponnesiaca, για το οποίο δεν έχουν πραγματοποιηθεί πολλές μελέτες, πέραν της σύστασης του αιθερίου ελαίου του και της νευροπροστατευτικής δράσης των εγχυμάτων και των εκχυλισμάτων του. Το συγκεκριμένο είδος είναι ενδημικό και φύεται στη Β. Πελοπόννησο, ενώ η συλλογή του υλικού έγινε από το όρος Χελμός.
Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη των φυσικών προϊόντων του εκχυλίσματος του οξικού αιθυλεστέρα του S. clandestina ssp. peloponnesiaca ως προς τη δομή και ως προς τη δράση τους έναντι του ενζύμου της ακετυλοχολινεστεράσης, που διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη νευροδιαβίβαση. Συγκεκριμένα, μελετήθηκαν δύο κλάσματα του ολικού εκχυλίσματος (ΓΔ3 και ΕΖΗ). Πραγματοποιήθηκε διαχωρισμός των συστατικών και των δύο κλασμάτων με την τεχνική της Παρασκευαστικής Χρωματογραφίας Λεπτής Στοιβάδας (PLC) και με Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (HPLC). Τελικά, απομονώθηκε η ένωση β-σιτοστερόλη η οποία ταυτοποιήθηκε με φασματομετρία μάζας, με πειράματα 1H-NMR και 13C-NMR καθώς και με πειράματα δύο διαστάσεων HSQC, HMBC, COSY και ROESY. Ακόμα, απομονώθηκε ο γλυκοζίτης φαινυλοπροπανοειδούς βερμπασκοζίτης που ταυτοποιήθηκε με φασματομετρία μάζας και 1H-NMR. Απομονώθηκαν επίσης δύο κλάσματα εκ των οποίων το πρώτο είναι μίγμα δύο γλυκοζυλιωμένων φαινυλοπροπανοειδών και το δεύτερο είναι μίγμα 6 συστατικών που περιλαμβάνουν γλυκοζίτες φαινυλοπροπανοειδών και παράγωγα γλυκοζυλιωμένων φλαβονοειδών. Η ταυτοποίηση των συστατικών τους πραγματοποιήθηκε με την τεχνική UPLC-ESI/MS.
Στη συνέχεια, εκτιμήθηκε η ανασταλτική δράση της β-σιτοστερόλης και των δύο μιγμάτων που προέκυψαν, έναντι της ακετυλοχολινεστεράσης από ηλεκτροφόρο χέλι και της βουτυρυλοχολινεστεράσης από ορό αλόγου, με τη χρήση της μεθόδου Ellman. Και τα τρία δείγματα εκδήλωσαν χαμηλή έως μέτρια αναστολή έναντι και των δύο ενζύμων. Συγκεκριμένα, το μίγμα των 6 φαινολικών συστατικών εμφάνισε την υψηλότερη αναστολή (37.44% στα 45.45 μg/mL στην eeAChE, 46.81% στα 50 μg/mL στην BuChE), ακολουθούμενο από το μίγμα των 2 φαινυλοπροπανοειδών που εμφάνισε μέτρια δράση (19.39% στην eeAChE, 26.96% στην BuChE στις ίδιες συγκεντρώσεις) και τελευταία τη β-σιτοστερόλη που εκδήλωσε μέτρια προς χαμηλή δράση και για τα δύο ένζυμα (28.35% στα 113.64 μg/mL στην eeAChE, 18.16% στα 125 μg/mL στην BuChE).
