Ο Streptococcus thermophilus είναι ένα θετικό κατά Gram βακτήριο,
προαιρετικά αναερόβιο, μη παθογόνο, άλφα αιμολυτικό και μέλος της ομάδας
viridians του γένους Streptococcus. Ανήκει στα θερμόφιλα βακτήρια γαλακτικού
οξέος (L.A.B.) και θεωρείται ασφαλής για κατανάλωση (Generally recognized as
safe, G.R.A.S.). Χρησιμοποιείται ευρέως ως εναρκτήρια καλλιέργεια για την
παραγωγή γαλακτοκομικών προϊόντων και θεωρείται ο δεύτερος πιο σημαντικός
οργανισμός στη βιομηχανία γαλακτοκομικών προϊόντων. Το στέλεχος S.
thermophilus ACA-DC 0040 από τη συλλογή του Γεωπονικού Πανεπιστημίου
Αθηνών παράγει την βακτηριοσίνη θερμοφιλίνη T, η σύνθεση της οποίας φαίνεται
ότι σχετίζεται με τον ρυθμό ανάπτυξης του οργανισμού και αποτέλεσε το αντικείμενο
μελέτης της παρούσας διατριβής.
Αρχικά διερευνήθηκε η ανάπτυξη του στελέχους ACA-DC 0040 σε μία σειρά
θρεπτικών μέσων συναρτήσει της παραγωγής βακτηριοσίνης, της απομόνωσης
γενετικού υλικού και της επιδεκτικότητας σε πειράματα μετασχηματισμού και
επιλέχθηκαν τα βέλτιστα κατά περίπτωση. Βάσει κατατεθειμένων αλληλουχιών DNA
άλλων στελεχών S. thermophilus, διερευνήθηκε και ανιχνεύθηκε ένας αντίστοιχος
γενετικός τόπος blp στο ACA-DC 0040 ο οποίος ενδεχομένως σχετίζεται με την
παραγωγή της θερμοφιλίνης Τ, κλωνοποιήθηκε και ταυτοποιήθηκε η αλληλουχία
του. Ο γενετικός αυτός τόπος αποτελείται από 13092 ζεύγη βάσεων και εντοπίζονται
σε αυτόν 16 ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης που κωδικοποιούν πιθανά δομικά πεπτίδια
της θερμοφιλίνης Τ και πεπτίδια ανοσίας, ένα ρυθμιστικό σύστημα 3 στοιχείων,
πρωτεΐνες για την εξωκυττάρια μεταφορά της φερομόνης και της θερμοφιλίνης, και
μία πρωτεΐνη τροποποίησης των δομικών πεπτιδίων της. Μεταξύ αυτών εδράζονται
γονίδια τρανσποζασών και άγνωστης λειτουργίας.
Η έκφραση και η οργάνωση των γονιδίων της περιοχής blp μελετήθηκε σε
μεταγραφικό επίπεδο με πειράματα RT-PCR και Northern, από τα οποία
αποκαλύφθηκε η ύπαρξη 5 πιθανών οπερονίων. Επιπλέον, τα πιθανά δομικά
γονίδια της βακτηριοσίνης blpU και blpK παρουσίασαν τόσο συμμεταγραφή, όσο και
ξεχωριστή μεταγραφή τουλάχιστον στην περίπτωση του πρώτου και για το λόγο
αυτό μελετήθηκαν περαιτέρω μέσω PCR πραγματικού χρόνου (real time PCR). Τα πειράματα αυτά αποκάλυψαν αυξημένα επίπεδα εμφάνισης των μεταγράφων σε
συνθήκες παρουσίας αντιμικροβιακής δραστικότητας και διαφορετικά επίπεδα
εμφάνισης των συμμεταγραφόμενων πεπτιδίων blpU-blpK από την ανεξάρτητη
μεταγραφή του blpU ανά συνθήκη αλλά πάντα με μεγαλύτερα επίπεδα μεταγραφής
του blpU.
Στη συνέχεια επιχειρήθηκε η εύρεση ενός κατάλληλου συστήματος
μεταφοράς και έκφρασης στο ACA-DC 0040. Στα πλαίσια αναζήτησης ή και
κατασκευής κατάλληλου πλασμιδιακού φορέα εντοπίστηκε ένα φυσικό πλασμίδιο
στο ACA-DC 0040 του οποίου η αλληλουχία ταυτοποιήθηκε και στην παρούσα
εργασία. Το πλασμίδιο, μεγέθους 2780 ζευγών βάσεων, ονομάστηκε pST0040 και
διαθέτει τρία ORFs που ομοιάζουν με γονίδιο αντιγραφής κυλιόμενου κύκλου, με
γονίδιο παραγωγής πρωτεΐνης άγνωστης λειτουργίας και πρωτεΐνης θερμικού σοκ
μικρού μοριακού βάρους, των οποίων οι ιδιότητες μελετήθηκαν. Το pST0040
χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή πλασμιδιακού φορέα με τον οποίο
πραγματοποιήθηκε μετασχηματισμός, αν και σε πολύ μικρή συχνότητα, στο S.
thermophilus LMG 18311. Τα αποτελέσματα από τα πειράματα των
μετασχηματισμών επιβεβαίωσαν τα δημοσιευμένα ευρήματα χαμηλών ποσοστών
επιτυχίας του μετασχηματισμού και την ανάγκη για επιπρόσθετες έρευνες στον
τομέα.
Τέλος, τα πιθανά δομικά πεπτίδια της θερμοφιλίνης Τ, blpU και blpK,
κλωνοποιήθηκαν, το καθένα ξεχωριστά, σε φορέα υπερέκφρασης στο E. coli και τα
ανασυνδυασμένα πεπτίδια που παρήχθησαν παρουσίασαν κάποιας μορφής
αντιμικροβιακή δραστικότητα έναντι του ευαίσθητου στη θερμοφιλίνη Τ Lactococcus
lactis CNRZ 117.
(EL)
Streptococcus thermophilus is a Gram-positive bacterium, facultative
anaerobe, non pathogenic, alpha hemolytic and member of the Streptococcus
viridans group. It belongs to the thermophilic lactic acid bacteria (L.A.B.) and is
considered safe to consume (Generally Recognized As Safe, G.R.A.S.). It is used
widely as a starter culture for the production of dairy products and is considered the
second most important organism in the dairy industry. The strain S. thermophilus
ACA-DC 0040 from the Agriculture University of Athens microorganism collection
produces the bacteriocin thermophilin T, the production of which seems to be related
to the growth rate of the organism and is the topic of this study.
Initially the growth of ACA-DC 0040 strain was tested with a series of growth
mediums in relation to bacteriocin production, genetic material purification and
competence in transformation experiments and the mediums were selected by case.
Based on deposited DNA sequences of other S. thermophilus strains, a
corresponding blp locus, possibly related to thermophilin T production, was found,
cloned and sequenced. This genetic locus consists of 13092 base pairs and 16 open
reading frames were found encoding putative structural thermophilin T peptides and
immunity peptides, a three component regulatory system, transportation proteins
and a modification protein for the structural peptides. Among these, transposase
and unknown function genes were found.
The expression and organization of blp region genes were studied at
transcriptional level using RT-PCR and northern experiments, revealing 5 possible
operons. In addition, the possible structural bacteriocin genes blpU and blpK
appeared to co-transcript as well as transcript independently, at least for the first
one, and for this reason they were further studied with real time PCR experiments.
Those experiments revealed higher levels of transcripts under conditions with
antimicrobial activity and different levels of the co-transcripted peptides blpU-blpK
in relation to independently transcripted blpU by condition but always with higher
levels of blpU transcription. Following, a suitable transfer and expression system for the ACA-DC 0040
strain was searched for. While searching for, or trying to create, a suitable plasmid
vector a native plasmid was found in ACA-DC 0040 whose sequence was identified
in the present study. The plasmid consisting of 2780 base pairs, was named
pST0040 and has three ORFs resembling a rolling circle replication gene, an
unknown function protein coding gene and a small molecular weight heat sock
protein coding gene, whose properties were studied. The pST0040 was used to
create a plasmid vector which was transformed, with a very small efficiency, in S.
thermophilus LMG 18311. The results confirmed the published low success
transformation rates of the species and the need for additional research in this
domain.
Finally the putative structural thermophilin T peptides, blpU and blpK, were
cloned separately in an E. coli overexpression plasmid vector and the produced
recombined peptides showed a form of antimicrobial activity against the
thermophilin T sensitive strain Lactococcus lactis CNRZ 117.
(EN)
University of Ioannina
