Το Zymomonas mobilis είναι ένα προαιρετικά αναερόβιο βακτήριο με βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον εξαιτίας της αυξημένης ποσότητας αιθανόλης που παράγει εν συγκρίσει με το μύκητα Saccharomyces cerevisiae, η οποία συνοδεύεται από μικρότερη παραγωγή βιομάζας και μη απαίτηση οξυγόνου. Για τη γενετική βελτίωση του βακτηρίου έχουν κατασκευαστεί ανασυνδυασμένα πλασμίδια – φορείς, τα οποία φέρουν και μέρη από τα φυσικά πλασμίδια του βακτηρίου, εφόσον είναι γνωστό ότι τα στελέχη του διαθέτουν ένα πλούσιο προφίλ πλασμιδίων με μεγάλη ποικιλία σε αριθμό και μέγεθος. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν οι ιδιότητες κινητοποίησης που φέρει το φυσικό πλασμίδιο pZA1003 του Z. mobilis NCIMB 11163. Συγκεκριμένα, κατασκευάστηκε με τρεις διαδοχικές κλωνοποιήσεις ένα ανασυνδυασμένο πλασμίδιο με βάση τον πλασμιδιακό φορέα pBR328, στον οποίο ενσωματώθηκαν οι περιοχές του pZA1003 που είναι απαραίτητες για την αντιγραφή στον ξενιστή του και για την κινητοποίησή του στα πλαίσια επιβοηθούμενης σύζευξης, όπως έχει διαπιστωθεί ότι συμβαίνει μεταξύ κυττάρων Eschericia coli. Το ανασυνδυασμένο αυτό πλασμίδιο ονομάστηκε pBRZArm, ενώ η ορθότητα της κατασκευής του επιβεβαιώθηκε με υβριδισμό Southern και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. Αφού η ικανότητα κινητοποίησης του pBRZArm διαπιστώθηκε με επιβοηθούμενη σύζευξη μεταξύ κυττάρων Eschericia coli, χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια σε πειράματα επιβοηθούμενης σύζευξης με κύτταρα δέκτες το Z. mobilis CP4Rif και βοηθητικό πλασμίδιο το pRK2013 που ανήκει στην ομάδα ασυμβατότητας IncP. Η επιτυχία της μεταφοράς του στο Z. mobilis επιβεβαιώθηκε με υβριδισμό Southern και μετασχηματισμό E.coli με το πλασμιδιακό εκχύλισμα των μετασυζευγμένων CP4Rif. Το pBRZArm μεταφέρθηκε με επιτυχία και πολύ καλή συχνότητα, ενώ η κληρονομική του σταθερότητα άγγιζε το 100 % για τουλάχιστον 130 γενεές σε συνθήκες ανάπτυξης χωρίς μέσο επιλογής για το πλασμίδιο. Οι ιδιότητες αυτές καθιστούν το pBRZΑrm κατάλληλο φορέα για την έκφραση ετερόλογης γενετικής πληροφορίας στο Z. mobilis. Τέλος, μελετήθηκε η κινητοποίηση του pBRZΑm μεταξύ κυττάρων Z. mobilis και συγκεκριμένα από το CP4Rif σε παράγωγο του ATCC 10988 ανθεκτικό στην τετρακυκλίνη. Αν και προέκυψαν αποικίες του κυττάρου δέκτη ανθεκτικές στη χλωραμφαινικόλη, το αντιβιοτικό επιλογής του pBRZΑrm, η ανάλυση του πλασμιδιακού περιεχόμενου και ο
μετασχηματισμός κυττάρων E. coli με αυτές δεν αποκάλυψαν την ύπαρξη του pBRZΑrm. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι οι ιδιότητες κινητοποίησης του pZA1003 δεν επάγονται παρουσία κάποιου από τα φυσικά πλασμίδια του Z. mobilis CP4Rif, είτε λόγω ασυμβατότητας μεταξύ τους, είτε λόγω μη ύπαρξης ολοκληρωμένης συζευκτικής λειτουργίας σε αυτά. Ωστόσο, η συζευκτική ικανότητα των ενδογενών πλασμιδίων του CP4 αλλά και των άλλων στελεχών του Z. mobilis χρήζει περαιτέρω μελέτης.
(EL)
Zymomonas mobilis is a bacterium able to grow under both aerobic and anaerobic conditions. It is of great biotechnological interest due to the higher yield of ethanol production in comparison with the fungus Saccharomyces cerevisiae. This high yield of ethanol production is accompanied by less biomass production and the lack of need for oxygen for the growth of its cells. A strategy used for the genetic improvement of this bacterium is the creation of cloning vectors that bear regions of its natural plasmids, since it is known that its strains contain many natural plasmids with a variety of sizes. In the present study, the ability of the natural plasmid pZA1003 of Z. mobilis NCIMB 11163 to mobilize has been examined. More precisely, a new cloning vector has been constructed, based on the broad host range plasmid pBR328, in which regions of the plasmid pZA1003 have been added. These regions are essential for its replication in its host and for its mobilization trough helped conjugation, the same way it happens between Escherichia coli cells. The success of the construction of this new cloning vector, named pBRZArm, has been validated through Southern hybridization and Polymerase Chain Reaction. The ability of pBRZArm to mobilize has been established primarily with helped conjugation between Eschericia coli cells. Consequently, it has been used for conjugation with Z. mobilis CP4Rif cells as recipients, with the aid of the helper plasmid pRK2013, which belongs to the INCP incompatibility group. The success of this second conjugation has been confirmed through Southern hybridization and transformation of E.coli cells with the conjugated CP4Rif cells. pBRZArm has been successfully transferred through conjugation, as well as with a great frequency. Also, it is almost 100 % stable in Z. mobilis cells for at least 130 generations, under non- selective conditions. According to those qualities, pBRZArm is a cloning vector appropriate for expression of foreign genetic information in Z. mobilis. Lastly, the ability of pBRZArm to mobilize between Z. mobilis cells has been examined, more precisely between CP4Rif and a tetracycline resistant derivative of ATCC 10988. Although colonies of the recipient cells have been observed, that were apparently resistant to the antibiotic of selection (chloramphenicol), plasmid DNA analysis and transformation of E. coli cells showed no presence of pBRZArm. This indicates that the mobilization abilities of pZA1003 cannot be induced in the presence of Z. mobilis CP4Rif natural plasmids, either due to incompatibility between the two, or to the lack of conjugational function in them. However, conjugative ability of endogenous plasmids of other Z. mobilis strains is yet to be examined.
(EN)
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων
