Η βραδυκινίνη είναι ένα εννεαπεπτίδιο (Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg), το οποίο προκύπτει με υδρόλυση από το μεγάλου μοριακού βάρους κινινογόνο, σε μια αντίδραση που καταλύεται από το ενεργοποιημένο ένζυμο του πλάσματος, την καλλικρεϊνη. Παρουσιάζει έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον καθώς εμπλέκεται σε μια ποικιλία φυσιολογικών δράσεων που σχετίζονται με την καρδιαγγειακή ομοιόσταση, τις φλεγμονώδεις, υπεραλγητικές αποκρίσεις και τους μηχανισμούς μετάδοσης του πόνου. Αυτές οι ενέργειες προωθούνται με ενεργοποίηση δύο τύπων υποδοχέων της, των Β1 και Β2 υποδοχέων, οι οποίοι ανήκουν στην οικογένεια των συζευγμένων με G-πρωτεΐνες υποδοχέων (GPCRs). Ειδικότερα, οι Β2R εκφράζονται συστηματικά στους περισσότερους ιστούς, γι’ αυτό και έχουν μελετηθεί σε μεγαλύτερο βαθμό. Αγωνιστές των υποδοχέων αυτών, με τους οποίους ασχολούμαστε στην παρούσα εργασία, έχει δειχθεί ότι εμπλέκονται μεταξύ των άλλων και στον καρκίνο του ανθρώπου, καθώς η ΒΚ μπορεί να διεγείρει την ανάπτυξη και να αυξήσει την αγγειακή διαπερατότητα των όγκων.
Η πλειοψηφία τέτοιων αγωνιστών που έχει συντεθεί και αναφέρεται στην βιβλιογραφία είναι πεπτιδικής φύσεως, έχουν όμως αναπτυχθεί και εκλεκτικοί, μη-πεπτιδικοί αγωνιστές (και ανταγωνιστές) των Β2 υποδοχέων της βραδυκινίνης με δυνατότητα χορήγησης από το στόμα, οι οποίοι προσδένονται ισχυρά σε αυτούς. Συντέθηκε πρόσφατα στο εργαστήριό μας μια ποικιλία αναλόγων και υβριδίων του αγωνιστή FR-190997, που έχει αναπτυχθεί από τη φαρμακευτική εταιρεία Fujisawa Pharmaceuticals Co, Japan, με βάση τη γενική μεθοδολογία της εν λόγω εταιρείας, πιστεύοντας ότι επειδή το μόριο FR-190997 εμπεριέχει δύο δομικά συστατικά (ένα κινολινικό δακτύλιο και ένα κινναμικό οξύ συνδεδεμένα μεταξύ τους με ένα γλυκινανιλίδιο) με τεκμηριωμένη αντικαρκινική δράση, τα συντεθέντα μόρια πολύ πιθανόν να έδειχναν αντικαρκινική δράση. Πράγματι, προκαταρκτικές βιολογικές δοκιμές με δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού, την MCF-7 (χαμηλό μεταστατικό δυναμικό) και την MDA-MB-231 (υψηλό μεταστατικό δυναμικό) έδειξαν ότι τόσο η FR-190997 όσον και ανάλογά της παρουσίαζαν πολύ ενδιαφέρουσα αντιπολλαπλασιαστική δραστικότητα.
Με βάση τα βιολογικά αποτελέσματα που ελήφθησαν από την προαναφερθείσα μελέτη, σκοπός της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας υπήρξε η σύνθεση μιας σειράς νέων αναλόγων που θα μας επέτρεπαν να μελετήσουμε περαιτέρω την επίπτωση των δομικών αλλαγών στην πιθανή αντιπολλαπλασιαστική δράση των εν λόγω μορίων και τη σχεδίαση δραστικότερων μορίων. Στην προηγούμενη μελέτη είχε δειχθεί ότι αντικατάσταση του κινναμικού οξέος (4-MacCA) του FR-190997 με το υδροξυκινναμικό οξύ φερουλικό ή το ρετινοειδές οξύ all-trans-ρετινοϊκό, με ταυτόχρονη ή όχι αντικατάσταση του Ο στη θέση 8 του κινολινικού δακτυλίου με ΝΗ οδηγεί σε ανάλογα με ισχυρότερη αντιπολλαπλασιαστική δράση σε μια από τις δύο κυτταρικές σειρές.
Στην παρούσα εργασία λοιπόν επιχειρήθηκε με επιτυχία η σύνθεση τριών νέων αναλόγων με αντικατάσταση του κινναμικού οξέος του FR-190997 με τα υδροξυκινναμικά οξέα καφεϊκό (30) και σιναπικό (35) οξύ και το ρετινοειδές οξύ sc-ATRA (38), για να διαπιστώσουμε την επίδραση μια επιπλέον ΗΟ-ομάδας ή ΜeO-ομάδας στο κινναμικό οξύ ή μικρότερης πολυενικής αλυσίδας στο ρετινοειδές οξύ, στην αντιπολλαπλασιαστική δράση αυτών των μορίων.
Η ενσωμάτωση όλων αυτών των μορίων αλλά και του ίδιου του 4-MacCA, όπου αυτό χρειάστηκε, στη δομή της FR-190997 έγινε μέσω των αντίστοιχων 'ενεργών' σουκινιμιδυλεστέρων 22, 23, 24, 25, που συντέθηκαν για το σκοπό αυτό.
Επίσης συντέθηκαν τα ενδιάμεσα κλειδιά Α, 31 και 17 που είναι απαραίτητα για την ανοικοδόμηση των μορίων-στόχων.
Η ανοικοδόμηση επιτυγχάνεται μέσω σύζευξης του 17 με τους ενεργούς εστέρες. H προκύπτουσα αλκοόλη Χ συζεύγνυται στη συνέχεια με την Α ή την 31 μέσω αντίδρασης Mitsunobu ή απλής αλκυλίωσης, αν η αλκοόλη Χ μετατραπεί πρώτα στο αντίστοιχο βρωμίδιο. Ακολουθεί/ούν αποπροστασία/ες ρουτίνας.
Στην παρούσα εργασία επιχειρήθηκε επιπλέον η σύνθεση δύο νέων αναλόγων με αντικατάσταση του κεντρικού cis Ν-μεθυλιωμένου αμιδικού δεσμού με τετραζολικό δακτύλιο (47) και της αιθερικής ομάδας στη θέση 8 του κινολινικού δακτυλίου με αμιδική ομάδα (66), για να διαπιστώσουμε την επίδραση των αλλαγών αυτών στην αντιπολλαπλασιαστική δράση των μορίων.
Αν και η σύνθεση των μορίων αυτών δεν ολοκληρώθηκε, συντέθηκαν τα ακόλουθα ενδιάμεσα-κλειδιά, τα οποία με περαιτέρω μελέτη θα μπορούσαν να οδηγήσουν στα επιθυμητά μόρια-στόχους.
Παράλληλα, επιτεύχθηκε και η σύνθεση και ενός αναλόγου (70) του B2R αγωνιστή FR-190997 στον οποίον απουσιάζει η (πυριδιν-2-υλ)μεθοξυ-ομάδα από τη θέση 4 του κινολινικού δακτυλίου, με σκοπό να προσδιορισθεί αν η ομάδα αυτή είναι απαραίτητη για την αντιπολλαπλασιαστική δράση του. Η ένωση αυτή αποτελεί ταυτόχρονα, όπως έδειξε η Fujisawa, ένα γνωστό ανταγωνιστή του B2R υποδοχέα,.
Η σύνθεση αυτή έλαβε χώρα με οξειδοαναγωγική σύζευξη της εμπορικά διαθέσιμης 2-methylquinolin-8-ol με το κύριο τμήμα Β, με χρήση της αντίδρασης Mitsunobu.
Τέλος, στο πλαίσιο της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας, συντέθηκε και μια σειρά αναλόγων της ένωσης 74 με αντικατάσταση της φθαλυλ-ομάδας με Η (75) ή ομάδα ουρεθανικού τύπου (76) ή ομάδα τύπου ουρίας (77) ή ακυλ-ομάδα (78-80) για να μελετήσουμε την επίπτωση της ομάδας πάνω στην πολύ ενδιαφέρουσα πολλαπλασιαστική δράση της 74 στην κυτταρική σειρά MCF-7 καρκίνου του μαστού. Σημειωτέον ότι η ένωση 74 αποτελεί ανάλογο του κεντρικού τμήματος C (ένα υποκατεστημένο γλυκινανιλίδιο) που συνδέει τον κινολινικό δακτύλιο με το κινναμικό οξύ του FR-190997.
Η αμίνη 75 προήλθε από την υδραζινόλυση του ενδιαμέσου 74 και απετέλεσε πρώτη ύλη-κλειδί για τη σύνθεση των αναλόγων 76-80. Τα ανάλογα αυτά προέκυψαν μέσω της συμπύκνωσης της αμίνης 75 με τα οξέα βουτυρικό, νικοτινικό, και (ινδολ-3-υλ)οξικό οξύ (ΙΑΑ), που βρίσκονται σε φυσικά προϊόντα με αντικαρκινική δράση ή τον χλωροφορμικό βενζυλεστέρα (benzyl chloroformate) ή τον ισοκυανικό βενζυλεστέρα (benzyl isocyanate).
Όλες οι ενώσεις που συντέθηκαν στο πλαίσιο της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας ευρίσκοντα υπό μελέτη για την αποτίμηση της αντιπολλαπλασιαστικής τους δραστικότητας στις κυτταρικές σειρές MCF-7 και MDA-MB-231 καρκίνου του μαστού.
Bradykinin is a nonapeptide (BK: Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg) resulting from hydrolysis of the High Molecular Weight Kininogen (HMWK) in a reaction catalyzed by the activated enzyme kallikrein. It is of great research interest as it is involved in a variety of physiological actions related to cardiovascular homeostasis, inflammatory, hyperalgesic responses and pain transmission mechanisms. These actions are promoted by activating two types of receptors, B1 and B2 receptors, which belong to the family of G-protein-coupled receptors (GPCRs). In particular, B2Rs are systematically expressed in most tissues, which is why they have been studied to a greater extent. Αgonists of these receptors, with which we are currently working on, have been shown to be involved in human cancer, among other things, as BK can stimulate growth and increase the vascular permeability of tumors.
The majority of such agonists that have been synthesized and referred to in the literature are peptides in nature. Selective, non-peptide agonists (and antagonists) of the B2 receptors of bradykinin suitable for oral administration, which bind strongly to them, have been also developed. We had recently synthesized in our laboratory, using a published general methodology, a variety of analogs and hybrids of the agonist FR-190997, on the anticipation that this molecule (FR-190997), and analogs thereof, would exhibit antiproliferative activity. This is because it contains two structural units (scaffolds), that is a quinoline ring and a cinnamic acid (connected through a glycinanilide bridge), with established anticancer activity. Agonist FR-190997 and related syntheses have been developed by the pharmaceutical company Pharmaceuticals Co in Japan. Preliminary biological tests with two breast cancer cell lines, namely the MCF-7 (low metastatic potential) and the MDA-MB-231 (high metastatic potential) showed that both FR-190997 and analogs thereof indeed exhibit very interesting antiproliferative activity.
Based on the results from these previous biological studies, the aim of the present postgraduate work was the synthesis of a series of new analogs which would allow us to study further the effect of structural changes on the potential antiproliferative activity of the now molecules and, hopefully, the design of more potent compounds. It had been shown in the afore mentioned previous studies that the replacement of cinnamic acid (4-MacCA) of FR-190997 by the hydroxycinnamic acid ferulic or the retionoid acid all-trans-ρετινοϊκό, with simultaneous or not replacement of the Ο atom at position 8 of the quinolone ring by ΝΗ, leads to analogs with improved antiproliferative activity in at least one of the two afore mentioned cell lines.
In the present work we successfully synthesized three new analogs with replacement of the cinnamic acid of FR-190997 with the hydroxicinnamic acids caffeic (30) and sinapic (35) and the retinoid acid sc-ATRA (38), to determine the effect of an additional ΗΟ- or ΜeO-group on cinammic acid or a shorter polyene chain in the retinoid acid, on the antiproliferative activity of these molecules.
Incorporation of all these molecules, including 4-MacCA where this is necessary, in the structure of FR-190997 was realized through the corresponding succinimidyl ‘active’ esters 22, 23, 24, 25, which were synthesized to this end.
Τhe key-intermediates Α, 31 και 17, which are necessary for the assembly of the target-molecules, were also synthesized.
The assembly of the target-molecules was effected through direct coupling of 17 with the corresponding active esters. The thus resulting alcohol Χ is then coupled with phenol Α or sulfonamide 31 through a Mitsunobu reaction or simple alkylation, if alcohol Χ were first converted to the corresponding bromide Y. The syntheses are then completed with routine deprotection(s).
In the context of the present work, the synthesis of two additional analogs was attempted with replacement of the central cis N-methylated amide bond by a tetrazole ring (47) or the ether functionality at position 8 of the quinolone ring with the amide group (66), to determine the effect of these changes on the antiproliferative activity of the molecules.
Although the synthesis of these molecules was not completed, a series of useful key-intermediates (e.g. 7, 31, 46, 60, 63, 67) were synthesized, which with further studies would allow the assembly of the skeleta of the desired target-molecules.
In addition, the synthesis of an analog (70) of the B2R agonist FR-190997 was effected in which the (pyridin-2-yl)methoxy group is absent from position 4 of the quinolone ring. This compound was synthesized in order to determine whether this particular group is necessary for the antiproliferative activity of FR-190997. Τhis particular compound constitutes, as Fujisawa have shown, a well-established antagonist of the B2R.
This synthesis took place through a redox condensation between the commercially available 2-methylquinolin-8-ol with the main part Β, using Mitsunobu reaction.
Finally, in the context of the present MSc thesis, a series of analogs of compound 74 was synthesized with replacement of the phthalyl group with Η (75), or an urethane group (76) or an urea group (77) or an acyl group (78-80) in order to study the effect of the functional group at the N atom on the very interesting antiproliferative activity of 74 in the breast cancer cell line MCF-7. It should be noted that compound 74 is an analog of the central part C (a substituted glyinanilide) connecting the quinolone ring and the cinnamic acid part of FR-190997.
Amine 75 was obtained through hydrazinolysis of intermediate 74 and is a key-starting material for the synthesis of analogs 76-80. The latter were unexceptionally obtained through the condensation of amine 75 with benzyl chloroformate or benzyl isocyanate or the carboxylic acids butyric, nicotinic and (indol-3-yl)acetic acid, respectively. These particular acids were chosen also because they are constituents of natural products with anticancer activity.
All synthesized compounds are currently under investigation for the evaluation of their antiproliferative activity in the breast cancer cell lines MCF-7 and MDA-MB-231.
