Ο καρκίνος του παχέος εντέρου ή ορθοκολικός καρκίνος αποτελεί την τρίτη αιτία
θανάτου από καρκίνο τόσο στους άντρες όσο και στις γυναίκες στις Η.Π.Α. και είναι ένας
από τους κυρίαρχους τύπους καρκίνου στις δυτικές βιομηχανοποιημένες χώρες. Οι
ανθρώπινες ιστικές καλλικρεΐνες (KLKs) αποτελούν μια υποοικογένεια 15 εκκρινόμενων
πρωτεασών σερίνης, οι οποίες κωδικοποιούνται από 15 δομικά όμοια γονίδια που
εδράζονται σε στενή διαδοχή στο χρωμόσωμα 19q13.4. Κύρια θέση εντόπισής τους είναι
το κυτταρόπλασμα των αδενικών επιθηλιακών κυττάρων, από όπου εκκρίνονται.
Πληθώρα μελετών έχει δείξει ότι η έκφραση των καλλικρεϊνών σε επίπεδο mRNA ή/και
πρωτεΐνης απορρυθμίζεται στον καρκίνο και έχει συσχετιστεί με την πρόγνωση, γι’ αυτό
οι καλλικρεΐνες έχουν προταθεί ως νέοι υποσχόμενοι βιοδείκτες καρκίνου ή ως πιθανοί
θεραπευτικοί στόχοι.
Η ανθρώπινη ιστική καλλικρεΐνη 7 (KLK7) είναι μια εκκρινόμενη πρωτεάση σερίνης
με ειδικότητα χυμοθρυψίνης. Η μεταγραφή του γονιδίου KLK7 παράγει 4 εναλλακτικά
mRNA μετάγραφα, που διαφέρουν μεταξύ τους ως προς την έλλειψη ενδιάμεσων
κωδικών εξωνίων και τη δομή των 5΄ και 3΄ αμετάφραστων περιοχών τους. Το ώριμο
ένζυμο συμμετέχει στον πρωτεολυτικό καταρράκτη αντιδράσεων κατά τη φυσιολογική
απολέπιση του δέρματος, αλλά και στη μετάβαση από επιθήλιο σε μεσέγχυμα και στην
πέψη συστατικών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας κατά την καρκινογένεση. Η ανθρώπινη ιστική καλλικρεΐνη 14 (KLK14) είναι εκκρινόμενη πρωτεάση σερίνης με
διττή ειδικότητα, θρυψίνης και χυμοθρυψίνης. Το γονίδιο KLK14 μεταγράφεται
παράγοντας ένα μοναδικό mRNA μετάγραφο. Φυσιολογικά, συμμετέχει στους
πρωτεολυτικούς καταρράκτες της απολέπισης της κεράτινης στιβάδας του δέρματος μαζί
με την KLK7 και της ρευστοποίησης του σπέρματος, αλλά και στην αποδόμηση
πρωτεϊνών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και στη διάσπαση πρωτεϊνών που
δεσμεύουν τους αυξητικούς παράγοντες τύπου ινσουλίνης (IGFBPs) κατά την ανάπτυξη,
τη διήθηση και τη μετάσταση του καρκίνου.
Σκοπός της παρούσας Διατριβής είναι η ανάλυση και η κλινική αξιολόγηση της
έκφρασης των γονιδίων KLK7 και KLK14 σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης τόσο σε
καρκινικούς και όσο και σε μη καρκινικούς ιστούς παχέος εντέρου, η μελέτη των mRNA
μεταγράφων των δυο γονιδίων σε καρκινικές κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου και
ιστούς, καθώς και η διερεύνηση του βιολογικού τους ρόλου στον καρκίνο του παχέος
εντέρου.
Η συνολική έκφραση mRNA των γονιδίων KLK7 και KLK14 προσδιορίστηκε ποσοτικά
σε καρκινικούς, φυσιολογικούς και αδενωματώδεις ιστούς παχέος εντέρου. H έκφραση
mRNA των KLK7 και KLK14 είναι σημαντικά αυξημένη στον καρκίνο σε σύγκριση με το
φυσιολογικό ιστό (p<0,001 και p=0,035, αντίστοιχα), όπως επίσης και στον καρκίνο σε
σύγκριση με τα αδενώματα (p<0,001 και για τα δυο). Τα επίπεδα έκφρασής τους δίνουν
τη δυνατότητα διάκρισης μεταξύ καρκινικού και αδενωματώδους ιστού (AUC=0,669 για
το KLK7 και AUC=0,708 για το KLK14, p<0,001 και για τα δυο), με την έκφραση mRNA του
KLK14 να έχει πιο ισχυρή διακριτική ικανότητα. Επίσης, δείχθηκε ότι τα δυο γονίδια συν-
εκφράζονται σε μέτριο βαθμό και στους τρεις τύπους ιστού που εξετάστηκαν
(φυσιολογικοί ιστοί rs=0,667, p<0,001; αδενώματα rs=0,373, p=0,001; καρκινώματα
rs=0,478, p<0,001), οπότε η έκφρασή τους απορρυθμίζεται συγχρονισμένα στον καρκίνο.
H υψηλή έκφραση mRNA του KLK7 και του KLK14 σχετίζεται στατιστικά σημαντικά με τη
διήθηση στους λεμφαδένες (p=0,015 και p=0,019, αντίστοιχα) και με προχωρημένο
στάδιο ΤΝΜ της νόσου (p=0,004 και p=0,043, αντίστοιχα). Η υψηλή έκφραση mRNA του
KLK14 σχετίζεται σημαντικά με μικρότερο χρόνο ελεύθερης νόσου (DFS) και ολικής (OS)
επιβίωσης (p=0,003 και p=0,016, αντίστοιχα) των ασθενών με καρκίνο, ενώ η υψηλή
έκφραση mRNA του KLK7 βρέθηκε να σχετίζεται σημαντικά μόνο με συντομότερη DFS επιβίωση (p=0,004). Συνεπώς, η έκφραση mRNA τόσο του KLK7 όσο και του KLK14 θα
μπορούσε να αποτελέσει υποψήφιο δείκτη δυσμενούς πρόγνωσης για τους ασθενείς με
καρκίνο στο παχύ έντερο, ωστόσο αλλά κανένας από τους δυο πιθανούς δείκτες δεν
είναι ανεξάρτητος.
Προσδιορίστηκε ανοσοϊστοχημικά η έκφραση των πρωτεασών KLK7 και KLK14 σε
τομές παραφίνης καρκινικών, φυσιολογικών και αδενωματωδών ιστών παχέος εντέρου.
Το πρότυπο εντόπισης των KLK7 και KLK14 εμφανίζει κατά βάση μεγάλη ομοιότητα στα
τρία είδη ιστού που εξετάστηκαν. Δεν παρατηρήθηκε έκφραση των δυο πρωτεασών στα
φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα, εκτός από κάποια ασθενή χρώση της KLK14 σε
στρωματικά κύτταρα. Αντίθετα, στα νεοπλασματικά αδενικά επιθήλια, αδενωματώδη ή
καρκινικά, και οι δυο πρωτεάσες εντοπίστηκαν με έντονη έκφραση, ιδιαίτερα προς την
αυλική επιφάνεια αλλά και στα εκκρίματα, εικόνα που συμβαδίζει με την εκκριτική τους
φύση. Η κυτταρική εντόπισή τους είναι κυτταροπλασματική, ομοιογενής για την KLK7 και
κοκκιώδης για την KLK14. H ανάλυση επιβίωσης έδειξε ότι η έκφραση της KLK7 είναι
σημαντικός ανεξάρτητος δείκτης δυσμενούς πρόγνωσης για την DFS επιβίωση (p=0,02)
και οριακά για την OS (p=0,054) των ασθενών, ενώ η έκφραση της KLK14 δεν βρέθηκε να
αποτελεί σημαντικό προγνωστικό δείκτη για την επιβίωση.
Τα εναλλακτικά mRNA μετάγραφα των γονιδίων KLK7 και KLK14 ανιχνεύτηκαν σε
καρκινικές κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου (HT-29, HCT 116, DLD-1, Caco2, LS 180) και
σε δεξαμενές cDNA από ιστούς παχέος εντέρου ταξινομημένους με βάση τον ιστολογικό
τους τύπο. Τα εναλλακτικά μετάγραφα 1, 2 και 3 του KLK7 εκφράζονται στις κυτταρικές
σειρές και στις δεξαμενές cDNA, ενώ το KLK7 μετάγραφο 4 όχι. Η έκφραση των KLK7
μεταγράφων 1 και 2, των οποίων η μετάφραση παράγει την ίδια λειτουργική πρωτεΐνη,
αυξάνεται στα αδενώματα και στον καρκίνο. Αντίθετα, η έκφραση του KLK7 μεταγράφου
3, το οποίο πιθανώς μεταφράζεται σε πρωτεΐνη που δεν διαθέτει ενεργότητα πρωτεάσης
σερίνης, εμφανίζει την υψηλότερη τιμή της στη φυσιολογική δεξαμενή cDNA, ενώ κατά
την πορεία της καρκινικής εξαλλαγής βαθμιαία μειώνεται και τελικά χάνεται, οπότε ίσως
έχει κάποιο φυσιολογικό ρυθμιστικό ρόλο. Το KLK14 mRNA μετάγραφο εκφράζεται
έντονα στις κυτταρικές σειρές, εκτός της Caco2, στην οποία εκφράζεται ασθενώς. Στις
δεξαμενές cDNA, η έκφραση του KLK14 mRNA μεταγράφου παρουσιάζει την υψηλότερη
αύξησή της στα αδενώματα, ενώ στην πορεία της νόσου εμφανίζεται ελαφρώς αυξημένη σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό. Ίσως το KLK14 μετάγραφο παίζει ρόλο στα αρχικά
στάδια της νεοπλασίας. Στις καρκινικές κυτταρικές σειρές, εκτός της Caco2, και σε
ορισμένες δεξαμενές cDNA εντοπίστηκε ένα νέο KLK14 mRNA μετάγραφο μικρότερου
μήκους από το κλασικό, από το οποίο απουσιάζει το ενδιάμεσο κωδικό εξώνιο 5.
Μετά την αποσιώπηση της έκφρασης του KLK7 με τη χρήση μικρών
παρεμβαλλόμενων μορίων RNA (siRNAs), διαπιστώθηκε μείωση της τάξης του 50% στην
ικανότητα των καρκινικών κυττάρων παχέος εντέρου HCT 116 για διήθηση στο
υπόστρωμα GFR MatrigelTM (p=0,016). Ομοίως, μετά από καταστολή της έκφρασης του
KLK14 με τη χρήση siRNAs, διαπιστώθηκε ιδιαίτερα μεγάλη μείωση της τάξης του 80%
στην ικανότητα των καρκινικών κυττάρων παχέος εντέρου DLD-1 να διηθούν το
υπόστρωμα GFR MatrigelTM (p=0,006). Συνεπώς, η έκφραση των πρωτεασών KLK7 και
KLK14 συμβάλλει στο διηθητικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων παχέος εντέρου in
vitro ενισχύοντας τον μεταστατικό φαινότυπο, αλλά δεν βρέθηκε να έχει επίπτωση στο
ρυθμό πολλαπλασιασμού τους.
Η αποσιώπηση του γονιδιου KLK7 είχε ως αποτέλεσμα μεταβολή στο πρωτεϊνικό
προφίλ των καρκινικών κυττάρων HCT 116, όπως έδειξε η Πρωτεομική ανάλυση. Μεταξύ
των πρωτεϊνών με πολύ σημαντική (p<0,01) μείωση της έκφρασής τους μετά την
καταστολή του KLK7 βρέθηκαν δυο μέλη της οικογένειας των πρωτεϊνών θερμικού σοκ
(heat shock proteins), τα HSP90B1 και HSPA4, τα οποία ενέχονται στην απόκριση σε
κυτταρικό στρες, καθώς και ο μεταγραφικός συμπαράγοντας TRIM28. Αντίθετα, τη
μέγιστη αύξηση έκφρασης εμφάνισε η αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη ANP32B και δυο μέλη
της οικογένειας των αννεξινών, τα ΑΝΧΑ1 και ΑΝΧΑ3, τα οποία απορρυθμίζονται στον
καρκίνο και έχουν συσχετιστεί με την ανάπτυξη του όγκου, τη διήθηση και τη μετάσταση.
Συμπερασματικά, οι KLK7 και KLK14 έχουν σημαντικά αυξημένη έκφραση στις
νεοπλασίες του παχέος εντέρου, μεταβάλλουν την έκφρασή τους συγχρονισμένα κατά
την πορεία της νόσου και σχετίζονται με προχωρημένο στάδιο ΤΝΜ και διήθηση στους
λεμφαδένες, αλλά και με την επιβίωση των ασθενών. Μπορούν να συμβάλλουν στην
πρόγνωση, αλλά όχι ως ανεξάρτητοι δείκτες. Εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα των
επιθηλιακών κυττάρων των αδενωμάτων και των αδενοκαρκινωμάτων, από όπου
εκκρίνονται και η υπερ-έκφρασή τους ενισχύει σημαντικά το διηθητικό και μεταστατικό
δυναμικό των καρκινικών κυττάρων.
(EL)
Colon or colorectal cancer constitutes the third leading cause of cancer death in men
and women in the U.S.A. and it is generally one of the prevalent cancer types in western
industrialized countries. Human tissue kallikreins (KLKs) form a subfamily of 15 secreted
serine proteases, which are encoded by 15 structurally similar genes that colocalize in
tandem on chromosome 19q13. KLKs are localized primarily in the cytoplasm of glandular
epithelia, from which they are secreted. A plethora of studies have shown that kallikrein
expression on the mRNA and/or protein levels is deregulated in cancer and it has been
correlated with prognosis, so kallikrein proteases have been proposed as promising novel
tumor biomarkers or as potential therapeutic targets.
Human tissue kallikrein-related peptidase 7 (KLK7) is a secreted serine protease with
chymotrypsin-like specificity. KLK7 gene transcription produces 4 alternative mRNA splice
variants that differ due to the absence of intermediate coding exons and the structure of
5΄ and 3΄untranslated regions. The mature enzyme participates in the proteolytic cascade
of normal skin desquamation, as well as in epithelial to mesenchymal transition and
cleavage of extracellular matrix components during cancer progression. KLK7 gene
expression has been correlated with unfavorable prognosis in breast, ovarian, cervical,
brain and colon cancer, but with favorable prognosis in lung adenocarcinoma.
Human tissue kallikrein-related peptidase 14 (KLK14) is a secreted serine protease
with dual specificity, trypsin- and chymotrypsin-like. KLK14 gene is transcribed into a single mRNA transcript. Normally, KLK14 participates in proteolytic cascades during
desquamation of the stratum corneum, together with KLK7, and semen liquefaction, as
well as in extracellular matrix protein degradation and cleavage of insulin-like growth
factor binding proteins (IGFBPs) during tumor growth, invasion and metastasis. KLK14
gene expression has been correlated with poor prognosis in breast, ovarian and prostate
cancer.
The aim of the present thesis was the analysis and clinical evaluation of the
expression of KLKs 7 and 14 at the mRNA and protein levels in cancerous and noncancerous
colon tissues, the study of KLKs 7 and 14 mRNA transcript variants in colon
cancer cell lines and tissues, as well as the investigation of their biological role in colon
cancer.
KLK7 and KLK14 mRNA expression was quantitatively assessed in cancer, normal and
adenomatous colon tissues. There is significantly higher mRNA expression of KLK7 and
KLK14 in cancer tissues than normal ones (p<0.001 and p=0.035, respectively), as well as
in cancer tissues compared to adenomas (p<0.001 for both of them). mRNA expression
levels of both genes have discriminatory value between cancer and adenoma tissues
(AUC=0.669 for KLK7 and AUC=0.708 for KLK14, p<0.001 for both), with KLK14 obtaining
greater distinguishing power. Moreover, both genes were shown to be fairly co-expressed
in all three types of colon tissues examined (normal rs=0,667, p<0,001, adenomas
rs=0.373, p=0.001, carcinomas rs=0,478, p<0.001), thus their expression is deregulated in
cancer in a coordinated manner. High mRNA expression of KLK7 and KLK14 is statistically
significantly associated with positive nodal status (p=0.015 and p=0.019, respectively), as
well as more advanced TNM stage of the disease (p=0.004 and p=0.043, respectively).
KLK14 high mRNA expression is significantly associated with shorter disease-free (DFS)
and overall survival (OS) of cancer patients (p=0.003 και p=0.016, respectively), whereas
KLK7 high mRNA expression is significantly associated only with shorter DFS (p=0.004).
Therefore, KLK7 and KLK14 gene expression could be regarded as candidate markers of
unfavorable prognosis for colon cancer patients, nevertheless not independent.
KLK7 and KLK14 protease expression was immunohistochemically evaluated in
paraffin-embedded colon cancer, adenoma and normal tissues. Localization pattern of
KLK7 and KLK14 proteins is primarily similar in all three types of tissue examined. There is no immunostaining in normal epithelial cells for none of the two KLKs, except for some
slight KLK14 immunostaining observed in stromal cells. Βoth proteases are intensely
expressed in neoplastic glandular epithelia, adenomatous or cancerous, especially
towards the luminal surface and in the secretions, which confirms their secretory nature.
Their cellular localization is cytoplasmic, homogeneous for KLK7 but granular for KLK14.
Survival analysis demonstrated that KLK7 expression is a significant independent indicator
of poor prognosis for DFS (p=0.02) and marginally for OS (p=0.054) of colon cancer
patients, whereas KLK14 expression was not found to be associated with survival time.
KLK7 and KLK14 mRNA transcript variants were detected in colon cancer cells lines
(HT-29, HCT 116, DLD-1, Caco2, LS 180) and cDNA pools from tissues classified according
to histological type. KLK7 splice variants 1, 2 and 3 are expressed in cell lines and cDNA
pools, whereas KLK7 variant 4 was not detected. KLK7 splice variants 1 and 2, which
produce the same functional protein isoform, showed increased expression in adenomas
and cancer. On the contrary, KLK7 splice variant 3, which produces a protein without
serine protease activity, showed its higher expression in normal tissues and a gradual
decrease and loss during the course of the disease, possibly exhibiting a physiological
regulatory role. The single KLK14 mRNA transcript is intensely expressed in cell lines,
except Caco2, in which it was slightly detected. KLK14 mRNA transcript showed its higher
expression in adenoma cDNA pool, while in the following stages of the disease it was not
intensely increased compared to normal tissue. This transcript may play a role in the early
tumorigenesis. In cell lines, except Caco2, and in certain cDNA pools, a new shorter than
the classical KLK14 mRNA isoform was detected, lacking the intermediate coding exon 5.
KLK7 gene expression silencing with the use of small interfering RNAs (siRNAs)
resulted in a 50% decrease of the invasive capacity of HCT 116 colon cancer cells to
infiltrate GFR MatrigelTM membrane (p=0.016). Likewise, KLK14 gene expression silencing
with siRNAs resulted in a particularly high 80% decrease of the invasive capacity of DLD-1
colon cancer cells to infiltrate GFR MatrigelTM membrane (p=0.006). Therefore, KLK7 and
KLK14 expression is associated with the invasive capacity of colon cancer cells in vitro by
enhancing their metastatic phenotype, but without any impact on their proliferative
ability.
(EN)
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων
