Τα νανοδομικά υλικά με βάση τον άνθρακα παρουσιάζουν σημαντικό ερευνητικό ενδιαφέρον στο πεδίο της νανοβιοκαταλυτικής και ενζυμικής βιοτεχνολογίας. Στόχος της παρούσας διατριβής είναι η ανάπτυξη νέων βιοκαταλυτικών συστημάτων μέσω της ακινητοποίησης ενζύμων σε νανοδομικά υλικά με βάση τον άνθρακα, μελετώντας και κατανοώντας τη σχέση δομής-λειτουργίας των ακινητοποιημένων ενζύμων με τα νανοϋλικά. Το αυξημένο ερευνητικό ενδιαφέρον για τα νανοϋλικά με βάση τον άνθρακα προκύπτει από τις ιδιαίτερες ιδιότητες που εμφανίζουν, όπως η αυξημένη ειδική επιφάνεια, η εξαιρετική μηχανική σταθερότητα, η ηλεκτρική και θερμική αγωγιμότητα, και οι ειδικές οπτικές ιδιότητες ανάλογα με το είδος του νανοϋλικού.
Νανοϋλικά με βάση τον άνθρακα, και πιο συγκεκριμένα νανοσωλήνες άνθρακα και οξείδιο του γραφενίου, χημικά τροποποιημένα για την εισαγωγή αλκυλικών αλυσίδων των οποίων τόσο το μήκος όσο και το είδος των τερματικών λειτουργικών ομάδων διαφέρει, χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη της επίδρασης της παρουσίας τους στα καταλυτικά και δομικά χαρακτηριστικά του κυτοχρώματος c. Η παρουσία των νανοϋλικών αυτών στο μέσο της αντίδρασης αυξάνει την καταλυτική ισχύ του κυτοχρώματος c έως και 78 φορές. Επιπλέον, τα νανοϋλικά σταθεροποιούν την πρωτεΐνη, προστατεύοντάς την από τη θερμική μετουσίωση και την απενεργοποίηση από υπεροξείδιο του υδρογόνου. Το κυτόχρωμα c διατηρεί τη δευτεροταγή δομή του παρουσία των νανοϋλικών αυτών, ενώ παρατηρούνται αλλαγές στο μικροπεριβάλλον της αίμης, οι οποίες οδηγούν σε μια αναδιαμόρφωση του ενεργού κέντρου κάνοντάς το πιο προσβάσιμο, με αποτέλεσμα την αυξημένη καταλυτική δραστικότητα της πρωτεΐνης.
Το κυτόχρωμα c ακινητοποιήθηκε σε διάφορα τροποποιημένα παράγωγα του οξειδίου του γραφενίου μέσω φυσικής προσρόφησης και ομοιοπολικής ακινητοποίησης. Η απόδοση της ακινητοποίησης και η καταλυτική συμπεριφορά της πρωτεΐνης επηρεάζονται από τη χημική σύσταση της επιφάνειας του νανοϋλικού, το μήκος της αλκυλικής αλυσίδας, τη λειτουργική ομάδα και τον τρόπο της ακινητοποίησης. Τα πειραματικά αποτελέσματα υποδεικνύουν ως κατάλληλους φορείς ακινητοποίησης τα τροποποιημένα παράγωγα του οξειδίου του γραφενίου. Η θερμική σταθερότητα του ακινητοποιημένου κυτοχρώματος c βελτιώνεται σε σχέση με την ελεύθερη πρωτεΐνη, ενώ ταυτόχρονα τα νανοϋλικά προστατεύουν το κυτόχρωμα c από αποδιατακτικούς παράγοντες όπως είναι η μεθανόλη και το υπεροξείδιο του υδρογόνου. Το ελεύθερο κυτόχρωμα c χάνει σχεδόν ολοκληρωτικά τη δραστικότητα του μετά από επώαση (24 ώρες και 30 λεπτά αντίστοιχα) με τους παράγοντες αυτούς, ενώ το ακινητοποιημένο κυτόχρωμα c διατηρεί μέχρι και το 50% της αρχικής δραστικότητάς του. Η ακινητοποίηση του κυτοχρώματος c έχει ως αποτέλεσμα την αλλαγή της δευτεροταγούς δομής του. Διαπιστώθηκε μείωση της περιεκτικότητας σε α-έλικα με ταυτόχρονη αύξηση της περιεκτικότητας σε β-φύλλα, γεγονός που υποδηλώνει πως η πρωτεΐνη υιοθετεί μια πιο άκαμπτη διαμόρφωση που θα μπορούσε να εξηγήσει την αυξημένη σταθερότητα του ακινητοποιημένου cyt c. Η δημιουργία πολυστρωματικών νανοσυστοιχιών νανοϋλικού-ενζύμου, μέσω ομοιοπολικής ακινητοποίησης πολλαπλών σημείων, οδηγεί στη δημιουργία καινοτόμων βιοκαταλυτών με βελτιωμένες ιδιότητες που μπορούν να βρουν εφαρμογή σε πλήθος βιομηχανικών διεργασιών. Οι νανοβιοκαταλύτες που παρασκευάσθηκαν αποτελούνται από εναλλασσόμενα στρώματα λακάσης και τροποποιημένου οξειδίου του γραφενίου, και παρουσιάζουν εξαιρετική σταθερότητα έναντι του ελεύθερου ενζύμου (διατήρηση έως και 40% της δραστικότητας ύστερα από 24 ώρες επώαση στους 60 οC). Επιπλέον, παρουσιάζουν αυξημένη καταλυτική δραστικότητα κατά την οξείδωση πολυκυκλικών αρωματικών υδρογονανθράκων και χρωστικών, ενώ διατηρούν μέχρι και το 94% της αρχικής τους δραστικότητας ύστερα από 5 διαδοχικούς κύκλους χρήσης (25 ώρες συνολικού λειτουργικού χρόνου).
Εν κατακλείδι, τα νανοδομικά υλικά με βάση τον άνθρακα βελτιώνουν σημαντικά την καταλυτική δράση των οξειδοναγωγικών πρωτεϊνών, οδηγώντας στη δημιουργία νέων βιοκαταλυτικών συστημάτων με ενδιαφέρουσες ιδιότητες. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής καταδεικνύουν τα σημαντικά πλεονεκτήματα που προκύπτουν από την εφαρμογή των νανοϋλικών ως φορείς για την ακινητοποίηση ενζύμων, και τα οποία αποτελούν τη βάση για την ανάπτυξη πλήθους εφαρμογών στο πεδίο της νανοβιοτεχνολογίας.
(EL)
Carbon-based nanomaterials have attracted the scientific interest in the field of nanobiocatalytic and enzyme biotechnology. The aim of this thesis is the development of novel nanobiocatalytic systems by means of immobilization of enzymes onto carbon-based nanostructured-supports, through the understanding of the correlation between structure and function of enzymes with these nanomaterials. The scientific interest of the carbon-based nanomaterials renders from their unique properties, such as high specific surface area, excellent mechanical stability, electrical and thermal conductivity, and special optical properties.
Carbon-based nanomaterials such as carbon nanotubes and graphene oxide, functionalized with different length of alkyl chains and functional groups, were used to study the effect of their presence on the catalytic and structural characteristics of cytochrome c. The presence of these functionalized nanomaterials in the reaction medium increases the catalytic efficiency of cytochrome c up to 78-fold. Furthermore, the nanomaterials stabilize the protein, as they protect it from thermal denaturation and hydrogen peroxide deactivation. Cytochrome c preserves its secondary structure in the presence of the functionalized nanomaterials, while the observed changes in the heme microenvironment suggest that the heme plane reorients in the active site pocket, possibly making the heme more accessible to the substrates and thus leading to higher peroxidase activity.
Cytochrome c was immobilized on functionalized derivatives of graphene oxide through physical adsorption and covalent binding. The immobilization efficiency and the catalytic behavior of the immobilized protein are affected by the surface chemistry, the alkyl chain length and the terminal functional group of the nanomaterials, as well as the immobilization procedure. The experimental results show that functionalized graphene oxide derivatives are excellent supports for protein immobilization. The thermostability of cytochrome c is improved upon immobilization, while the nanomaterials seem to offer a protective role against denaturing agents, such as methanol and hydrogen peroxide. Free cytochrome c is almost deactivated after incubation against those agents (24 h and 30 min respectively), while the immobilized protein retains up to 50% its initial activity. The immobilization of cytochrome c on the functionalized nanomaterials results in changes in the secondary structure of the protein. More specific, a loss in the α-helical content is observed, while the content of β-sheets is increased, indicating that the protein undergoes a conformational transition to a more rigid structure, which could explain the increased stability of the immobilized protein.
The development of multi-layer nanomaterial-enzyme nanoassemblies, through multi-point covalent immobilization, leads to the synthesis of novel biocatalysts with improved properties which can be used in numerous industrial applications. The prepared nanobiocatalysts consist of alternate layers of laccase and amino-functionalized graphene oxide and present excellent thermal stability compared to the free enzyme (preservation up to 40% of their initial activity after 24 hours incubation at 60 οC). In addition, the multi-layer nanoassemblies present excellent oxidation activity against polycyclic aromatic hydrocarbons and dyes, while they are able to retain up to 94% of their initial activity after 5 uses (25 hours of total operation).
In conclusion, carbon-based nanomaterials improve the catalytic behavior of redox proteins, leading towards the development of novel biocatalytic systems with interesting properties. The results of this study demonstrate the significant benefits arising from the implementations of nanosturctured materials as supports for enzyme immobilization, and form the basis for the development of numerous applications in the field of nanobiotechnology.
(EN)
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων
