Η νόσος του Parkinson (PD) είναι μια προοδευτική κινητική νευροεκφυλιστική
διαταραχή η οποία προσβάλλει περίπου το 1% των ενηλίκων ηλικίας άνω των 60 ετών.
Οφείλεται στην εκλεκτική εκφύλιση των ντοπαμινεργικών νευρώνων της μέλαινας ουσίας
και χαρακτηρίζεται από συσσώρευση συσσωματωμάτων ινιδιακής μορφής της πρωτεΐνης
α-synudein και εξασθένηση της μιτοχονδριακής λειτουργίας. Η a-synuclein είναι μια
μικρή όξινη πρωτεΐνη αποτελούμενη από 140 αμινοξέα, η οποία εντοπίζεται κυρίως στις
προσυναπτικές νευρικές απολήξεις. Αυξημένη έκφραση της άγριου τύπου a-synuclein
οδηγεί σε δυσλειτουργία των ντοπαμινεργικών νευρώνων σε διαγονιδιακά μοντέλα
ποντικών. Τα μιτοχόνδρια είναι ζωτικής σημασίας για την επιβίωση και λειτουργία των
νευρικών κυττάρων, καθώς είναι οι βασικοί ρυθμιστές του μεταβολισμού της ενέργειας,
της ενδοκυτταρικής ομοιόστασης του ασβεστίου, της αναλογίας NAD+/NADH, της
παραγωγής ενεργών ριζών οξυγόνου και της απόπτωσης. Η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία
επάγει τη συσσωμάτωση της
a
-synuclein, η οποία και αποτελεί το κύριο συστατικό των
σωματίων του Lewy, ενώ από την άλλη πλευρά η a-synuclein μπορεί να οδηγήσει σε
δοσοεξαρτώμενη απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης Δψω. Οι
μηχανισμοί που διέπουν την αλληλεπίδραση μεταξύ της α-synuclein και τη μιτοχονδριακή
δυσλειτουργία καθώς και η πιθανή συμμετοχή τους στη νευροεκφύλιση δεν είναι ακόμη
σαφείς. Στόχος αυτής της διατριβής ήταν η δημιουργία κατάλληλων κυτταρικών μοντέλων
για τη διερεύνηση των μοριακών αλληλεπιδράσεων και των σηματοδοτικών μονοπατιών
που εμπλέκονται στην προοδευτική εκδήλωση της νόσου του Parkinson, με επίκεντρο την
επίδραση της a-synuclein στη μιτοχονδριακή λειτουργία. Ως τέτοια μοντέλα επιλέξαμε την
ανάπτυξη κυττάρων κάτω από συνθήκες που επιβαρύνουν την κατάσταση των
μιτοχονδρίων στα νευρικά κύτταρα όπως η έκθεση σε νευροτοξίνες που αυξάνουν το
φορτίο των ελεύθερων ριζών, καθώς και τη δημιουργία μιας ιδιαίτερης κατηγορίας
υβριδικών κυττάρων (cybrids) αντικαθιστώντας τα μιτοχόνδρια υγιών νευρικών κυττάρων
με τα μιτοχόνδρια ασθενών με κληρονομικές μορφές της νόσου. Αναπτύξαμε και
χαρακτηρίσαμε και τα δύο μοντέλα. Η λεπτομερής ανάλυση του πρώτου από αυτά,
οδήγησε στην ταυτοποίηση της μιτοχονδριακής πρωτεάσης LonPl, μιας πρωτεΐνης που
ήταν ήδη γνωστή για το ρόλο της στην ομαλή λειτουργία των μιτοχονδρίων. Τα πειράματά
μας αποκάλυψαν για πρώτη φορά, μια πιθανή σύνδεση αυτής της πρωτεΐνης με την
εμφάνιση παθολογικών χαρακτηριστικών της νόσου στα νευρικά κύτταρα, όπως η συσσωμάτωση της a-synuclein και η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία. Για την ανάπτυξη του πρώτου μοντέλου, καλλιεργήσαμε κύτταρα νευρικής
προέλευσης, υπό συνθήκες ήπιας αλλά συνεχούς (χρόνιας) πρόκλησης οξειδωτικού
stress.
Χρησιμοποιήθηκαν τα ανθρώπινα νευροβλαστωματικά κύτταρα SHSY5Y και η
κατεχολαμινεργική νευροτοξίνη 6-υδροξυντοπαμίνη (6-OHDA), ένα υδροξυλιωμένο
ανάλογο της ντοπαμίνης (DA). Η ουσία αυτή συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα, επάγει
το σχηματισμό υπεροξειδίου του υδρογόνου και αναστέλλει τη δραστικότητα του
συμπλόκου I της μιτοχονδριακής αναπνευστικής αλυσίδας. Διαπιστώσαμε ότι η χρόνια
έκθεση των SHSY5Y κυττάρων στις συγκεντρώσεις 1 μΜ και 5 μΜ 6-OHDA για 16
συνεχόμενες γενιές (passages, P) επάγει το σχηματισμό εγκλείστων α-synuclein (τα οποία
αρχίζουν να εμφανίζονται από τη γενιά P:12), όπως επίσης και μια σημαντική αύξηση των
επιπέδων της πρωτεΐνης, στη γενιά P:16. Ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα ήταν η παρατήρηση ότι
ορισμένα από τα έγκλειστα, παρουσιάζουν μορφολογία σωματίων του Lewy, αφού
περικλείουν στο εσωτερικό τους τη φωσφορυλιωμένη μορφή της a-synuclein στο
κατάλοιπο σερίνης 129 (S129). Αυτοί οι φαινότυποι συνοδεύονται από μείωση του
δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης T ^m και αυξημένη μετακίνηση της a-synuclein
στα μιτοχόνδρια. Επιπλέον, κάτω από τις ίδες συνθήκες παρατηρήθηκε ενεργοποίηση, και
είσοδος των ενεργών μορφών της κινάσης Akt, καθώς και του μεταγραφικού παράγοντα
FOXO3a στα μιτοχόνδρια.
Ανάλυση με φασματομετρία μάζας μιτοχονδριακών εκχυλισμάτων, για την εύρεση
μιτοχονδριακών πρωτεϊνών οι οποίες απορρυθμίζονται σε κύτταρα SH-SY5Y τα οποία
υπερεκφράζουν άγριου τύπου ή μεταλλαγμένες μορφές της α-syn και έχουν εκτεθεί σε
rotenone, αποκάλυψε ένα σύνολο πρωτεϊνών, μεταξύ των οποίων ήταν πρωτεΐνες
απόκρισης στο
stress,
καθώς και η μιτοχονδριακή πρωτεάση LonP1. Σε συνθήκες
υπερέκφρασης της
a
-synuclein σε συνδυασμό με τη χρήση των νευροτοξινών rotenone και
6-OHDA παρατηρήθηκε μια έντονη αυξορύθμιση της LonPl. Περαιτέρω έλεγχος στο
μοντέλο χρόνιας έκθεσης αποκάλυψε μια έντονη μετατόπιση της πρωτεάσης στο
κυτταρικό διαμέρισμα του πυρήνα, ενώ η βιοχημική ανάλυση έδειξε ότι η πρωτεΐνη αυτή
κατανέμεται στο κλάσμα των πρωτεϊνών που συνδέονται ισχυρά με την χρωματίνη.
Πειράματα ανοσοκατακρήμνισης για την LonP1 σε συνδυσμό με ανάλυση
φασματομετρίας μάζας οδήγησαν στην ταυτοποίηση μιας σειράς πρωτεϊνών οι οποίες
αλληλεπιδρούν με την πρωτεάση μόνο στις συνθήκες εμφάνισης των παθολογικών
κυτταρικών χαρακτηριστικών, στο μοντέλο χρόνιας έκθεσης. Οι πρωτεΐνες αυτές
εμπλέκονται κυρίως σε βιολογικές διαδικασίες σχετικές με την αντιγραφή του DNA, τη μεταγραφή και τη μετάφραση. Η συγκριτική πρωτεωμική ανάλυση επιλεκτικά για τις
πυρηνικές πρωτεΐνες, αποκάλυψε ριβοσωμικές πρωτεΐνες, πρωτεΐνες που δεσμεύονται και
αλληλεπιδρούν με το DNA, πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην αντιγραφή και μεταγραφή
του DNA, στη λειτουργία του πρωτεασώματος κ.α. Τα ευρήματα αυτά ενισχύουν το
ενδεχόμενο εμπλοκής της μιτοχονδριακής πρωτεάσης LonPl σε ένα νέο ρόλο εντός του
πυρήνα, αφήνοντας ανοιχτό το ενδεχόμενο να αποτελεί κομβικό μόριο στην επικοινωνία
μεταξύ μιτοχονδρίου και πυρήνα (για παράδειγμα, επηρεάζοντας την έκφραση
επιλεγμένων γονιδίων του πυρήνα ώς ως απάντηση στο ήπιο οξειδωτικό
stress).
Τέλος,
από τα πειράματα ανοσοκατακρήμνισης επιβεβαιώθηκε ότι η Hsp90 αλληλεπιδρά άμεσα
με την LonPl, μια παρατήρηση που δεν ήταν προηγούμενα γνωστή.
Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη οδήγησε στην ανάπτυξη ενός αξιόπιστου
in
vitro
συστήματος για τη μελέτη του προοδευτικού χαρακτήρα της νόσου του Parkinson.
Με μια σειρά βιοχημικών και κυτταροβιολογικών μεθόδων αποδείξαμε ότι στο σύστημα
αυτό αναπαράγονται πολλά από τα παρκινσονιακά χαρακτηριστικά που έχουν κατά
καιρούς αναφερθεί σε προηγούμενες
in vitro
και
in vivo
μελέτες, και μάλιστα με μια
συγκεκριμένη χρονική ακολουθία, και ταυτοποιήσαμε έναν νέο ρόλο για τη μιτοχονδριακή
πρωτεάση LonPl στον πυρήνα, πιθανά σημαντικό για την πορεία της νόσου Parkinson.
Τέλος, εστιάζοντας στη μιτοχονδριακή λειτουργία, εγκαθιδρύσαμε και αναπτύξαμε
υβριδικές κυτταρικές σειρές, οι οποίες περιέχουν μιτοχόνδρια ασθενών με την
κληρονομική μορφή της νόσου του Parkinson, καθώς και από υγιή συγγενικά τους άτομα.
Ακολούθησε πλήρης χαρακτηρισμός αυτών των σειρών, όσον αφορά βασικές κυτταρικές
ιδιότητες όπως είναι η λειτουργικότητα των μιτοχονδρίων, ο πολλαπλασιασμός και η
ικανότητα διαφοροποίησής τους, και έγινε έλεγχος του βαθμού των νουκλεοτιδικών
αλλαγών που έχουν συσσωρευτεί στη μιτοχονδριακή αλληλουχία, με μεθοδολογία
αλληλούχισης νέας γενιάς
(deep sequencing).
Παρότι δεν ανιχνεύθηκαν διαφορές μεταξύ
«PD» και «υγιών» cybrids, τα κύτταρα αυτά παραμένουν στη διάθεσή μας ως ένα
πολύτιμο πειραματικό μοντέλο το οποίο σε συνδυασμό με το μοντέλο του χρόνιου
stress
θα μπορούσε μελλοντικά να συμβάλλει στην κατανόηση του ρόλου της μιτοχονδριακής
δυσλειτουργίας στην νόσο του Parkinson.
(EL)
Parkinson’s disease (PD) is a progressive, neurodegenerative movement disorder that
affects approximately 1% of adults aged 60 and over. It is characterized by the selective
degeneration of dopaminergic neurons in the substantia nigra, accumulation of α-synuclein
(α-syn) fibrils, and impaired mitochondrial function. Alpha-synuclein is a small acidic
protein consisting of 140 amino acids, located mainly in the presynaptic terminals.
Increased expression of wild type α-syn leads to dopaminergic neuron degeneration in
transgenic mouse models. Mitochondria are vital for neuronal cell survival and function, as
they are key regulators of energy metabolism, intracellular calcium homeostasis,
NAD+/NADH ratio, generation of endogenous reactive oxygen species and apoptosis.
Mitochondrial dysfunction induces α-syn aggregation, which constitutes the main
component of Lewy bodies. On the other hand, α-syn can lead to a dose-dependent loss of
mitochondrial transmembrane potential (Γυm). The mechanisms underlying the interplay
between α-syn and mitochondrial dysfunction, as well as their potential involvement in
neurodegeneration are not yet clear. The aim of this thesis was the generation of relevant
cellular models for investigating molecular interactions and signaling pathways that are
involved in the progressive appearance of PD-related cell phenotypes, focusing on the
influence of α-synuclein in mitochondrial function. As such models, we considered the
exposure of neuronal cells in conditions that lead to mitochondrial impairment, namely the
presence of neurotoxins that increase the load of free radicals, and the generation
cytoplasmic hybrid cells (cybrids) by replacing the mitochondria of healthy neuronal cells
with the mitochondria from patients with inherited forms of the disease. We developed and
characterized both models. The detailed analysis of the first of model, led to the
identification of mitochondrial LonP1 protease, a protein already known for its role in
protein quality control in mitochondria. Our experiments uncovered a previously unknown
connection of this protein with the occurrence of pathological features of the disease in the
neuronal cells, such as α-synuclein aggregation and mitochondrial dysfunction.
In order to develop the first model, we cultured cells of neural origin in conditions
of mild but continuous (chronic) oxidative stress challenge. We used the SHSY5Y human
dopaminergic neuroblastoma cells and the catecholaminergic neurotoxin 6-
hydroxydopamine (6-OHDA), a hydroxylated analog of dopamine (DA). This substance is
accumulated in the cytoplasm, induces the formation of hydrogen peroxide and inhibits the
activity of the mitochondrial respiratory chain complex I. We found that prolonged exposure of SHSY5Y cells to low concentrations of 6-OHDA (1ιM and 5ιM) for 16
consecutive cell passages (P:16) induces formation of α-synuclein inclusions (which are
starting to emerge from P:12), and leads to a significant increase in α-syn protein levels.
Importantly, some of these inclusions exhibit Lewy body appearance as revealed by the
phosphorylation of α-syn at the serine residue 129 (S129). These phenotypes are
accompanied by a reduction of the mitochondrial membrane potential (Γυm), and an
increased accumulation of α-syn in mitochondria. Furthermore, under the same conditions
we observed activation and translocation of the active forms of Akt kinase and the
transcription factor FOXO3a in mitochondria.
A mass spectrometry screen to identify mitochondrial proteins that are
differentially expressed in rotenone-stressed SH-SY5Y cells overexpressing wild-type or
mutant forms of alpha-synuclein revealed a set of proteins, including the mitochondrial
protease LonP1. A marked upregulation of LonP1 was observed in conditions where the
cells were overexpressing α-synuclein in the presence of 6-OHDA, but not in either
condition alone. Further scrutiny in the chronic model revealed a considerable
translocation of this protease in the nucleus of the treated cells, and biochemical
fractionation revealed a tight association of LonP1 with the chromatin.
Immunoprecipitation experiments combined with mass spectrometry (MS) led to the
identification of proteins that interact with LonP1 selectively in the PD-related condtions.
These proteins are mainly involved in biological processes related to DNA replication,
transcription and translation as well as in proteasome function. These findings put forward
a new role of the mitochondrial protease LonP1 in the nucleus, and leave open the
possibility that LonP1 may be a key molecule in the communication between mitochondria
and nucleus (for example, by affecting the expression of selected nuclear genes in response
to a mild oxidative stress). The immunoprecipitation experiments confirmed that Hsp90
interacts directly with LonP1, an observation that was previously unknown.
In conclusion, this study has led to the development of a reliable in vitro system to
study the progression of Parkinson’s disease. By using a series of biochemical and cell
biology approaches we demonstrated that this system can faithfully recapitulate many of
the key PD features that have been reported in previous in vitro and in vivo studies, in a
chronological order, and we have identified a new role of the mitochondrial protease
LonP1 in the nucleus, probably important for the advancement of Parkinson's disease.
Finally, focusing on the mitochondrial function, we developed cybrid cell lines containing mitochondria from patients with the inherited form of PD as well as from healthy relatives.
We characterized basic cellular properties such as mitochondria function, proliferation and
differentiation potential, and examined possible nucleotide changes using next generation
sequencing approaches (deep sequencing). Although no differences were detected between
«PD» and «healthy» cybrids, these cell lines constitute a valuable experimental model,
which in conjuction with the chronic stress model could be explored in future studies to
contribute to the understanding of the role of mitochondria dysfunction in Parkinson's
disease.
(EN)
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων
