Με τον όρο πνευμονική υπέρταση ορίζεται η αύξηση της πνευμονικής αρτηριακής πίεσης σε τιμές μεγαλύτερες από τις φυσιολογικές. Αυτή η αύξηση έχει ως άμεση συνέπεια την πρόκληση υπερφόρτισης πίεσης της δεξιάς κοιλίας της καρδιάς, η οποία οδηγεί αρχικά σε υπερτροφία και τελικά σε δεξιά καρδιακή ανεπάρκεια και ακόμη και στο θάνατο. Πράγματι, η πνευμονική αρτηριακή υπέρταση (pulmonary arterial hypertension, PAH) αποτελεί μια θανατηφόρο νόσο με μεγάλα ποσοστά θνησιμότητας και νοσηρότητας. Επίσης, αν δεν διαγνωσθεί και αντιμετωπιστεί έγκαιρα, μετά η μέση επιβίωση είναι μόλις 2,8 έτη. Όμως, παρόλα αυτά, ακόμα και στις μέρες μας, η πρόγνωση και η διάγνωσή της ουσιαστικά εξακολουθεί να καθορίζεται από την ανάπτυξη υπερτροφίας και τελικά από τη διάταση και δυσλειτουργία της δεξιάς κοιλίας.
Γενικά, για την αντιμετώπιση της πνευμονικής υπέρτασης υπάρχουν τρεις κύριες θεραπευτικές επιλογές, οι οποίες είναι οι φαρμακολογικές θεραπείες, η μηχανική υποστήριξη της δεξιάς κοιλίας (με τη χρήση συσκευών υποβοήθησης), και η χρήση βιοϋλικών και εμφυτευμάτων. Αναφορικά με την τελευταία, η βιβλιογραφική ανασκόπηση δείχνει ότι δεν υπάρχει συστηματική καταγεγραμμένη εμπειρία για εμφυτεύματα για χρήση στο μυοκάρδιο της δεξιάς κοιλίας μετά από πνευμονική υπέρταση. Η παρούσα εργασία επικεντρώνεται στην κάλυψη του κενού αυτού, προτείνοντας, εν είδει Οδικού Χάρτη (Road Map), μία στρατηγική ανάπτυξης βιοϋλικών για κατασκευή εμφυτευμάτων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την αντιμετώπιση (πρόληψη, θεραπεία) της πνευμονικής υπέρτασης. Έτσι η έρευνα που αναλήφθηκε στην παρούσα διατριβή έχει δύο διακριτά στάδια. Το πρώτο αφορά στην επιλογή, στην πρόκριση και στην αριστοποίηση του βιοϋλικού που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για το σκοπό αυτό. Το δεύτερο αναδεικνύει τη μελέτη (υπό το πρίσμα της βιολογίας, της ιατρικής, της μικροδομής, της χημείας, και της μηχανικής) της διεπιφάνειας και των αλληλεπιδράσεων μεταξύ του εμφυτεύματος και της εξωτερικής επιφάνειας του μυοκαρδίου όπου τοποθετείται η μεμβράνη, ως μείζονος σπουδαιότητας ζήτημα για την πρόβλεψη και την κατανόηση της απόδοσης του βιοϋλικού στην αντιμετώπιση της νόσου, ακολουθώντας το ενδεδειγμένο ιατρικό πρωτόκολλο που θα προτείνει ο χειρουργός για τη συγκεκριμένη εφαρμογή.
Αφού προκρίθηκε το σχήμα του εμφυτεύματος, ως η καταλληλότερη επιλογή για το βιοϋλικό που θα εφαρμοστεί στη συγκεκριμένη περίπτωση (και για τη φάση της έρευνας που αναλήφθηκε στην παρούσα εργασία), ορίστηκαν οχτώ κριτήρια πρόκρισης, τα οποία πρέπει να ικανοποιεί ένα βιοϋλικό για να μπορεί να επιλεγεί ως υποψήφιο να χρησιμοποιηθεί στην αντιμετώπιση της νόσου. Αυτά ήταν (1) η δυνατότητα δημιουργίας μεμβράνης,
(2) τα καλά ποιοτικά χαρακτηριστικά της μεμβράνης, (3) η ευκαμψία για να μπορεί να περιβάλλει επικαρδιακά τον ιστό, (4) οι ελεγχόμενες-ρυθμιζόμενες μηχανικές ιδιότητες ώστε να είναι παρόμοιες με αυτές του καρδιακού ιστού, (5) το ελεγχόμενο-ρυθμιζόμενο πάχος, (6) το ουδέτερο pH, (7) η βιοσυμβατότητα in vitro και in vivo, και (8) η ικανότητα βιοαποικοδόμησης σε συγκεκριμένο χρονικό διάστημα. Αναπτύχθηκαν μια σειρά υδροπηκτωμάτων, ξεκινώντας από το PEG (πολυ(αιθυλενογλυκόλη)) και τα παράγωγά του PEGSDA (PEG sebacate diacrylate) και OPF (oligo poly(ethylene glycol) fumarate), και στη συνέχεια υδροπηκτώματα των φυσικών πολυσακχαριτών με βάση το αλγινικό οξύ και τη χιτοζάνη. Τα πρώτα υδροπηκτώματα με βάση το PEG καθώς και αυτό του αλγινικού οξέος δεν ικανοποιούσαν τα κριτήρια πρόκρισης και για το λόγο αυτό αποκλείστηκαν από περαιτέρω θεώρηση και μελέτη. Αντίθετα, τα υδροπηκτώματα της χιτοζάνης έδειξαν καλύτερη συμπεριφορά και για το λόγο αυτό, έγινε εις βάθος μελέτη διαφόρων τρόπων παρασκευής του υδροπηκτώματος αυτού με σκοπό να ικανοποιηθούν τα κριτήρια πρόκρισης. Οι παράμετροι που ελέγχθηκαν ήταν το μοριακό βάρος της χιτοζάνης (χρησιμοποιήθηκε μεσαίου και χαμηλού μοριακού βάρους χιτοζάνη), το διάλυμα εξουδετέρωσης (NaOH, KOH, β-GP), και ο τρόπος εξουδετέρωσης (εμβάπτιση ή αργή ενστάλαξη). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι κάθε συνδυασμός των τριών αυτών παραγόντων επηρεάζει το μηχανισμό σχηματισμού του υδροπηκτώματος και κατά συνέπεια την ποιότητα του τελικού προϊόντος. Τελικά, η μεμβράνη με τις βέλτιστες ιδιότητες παρασκευάστηκε με τη μέθοδο της ζελατινοποίησης, χρησιμοποιώντας ως παράγοντα εξουδετέρωσης διάλυμα NaOH, χωρίς να πραγματοποιηθεί εξάτμιση διαλύτη.
Οι ιδιότητες της μεμβράνης αυτής, που ικανοποιούσε τα κριτήρια επιλογής, προσδιορίστηκαν πειραματικά. Αυτές ήταν ο προσδιορισμός του βαθμού αποακετυλίωσης, τα δομικά χαρακτηριστικά της μεμβράνης που προσδιορίστηκαν με τη χρήση περίθλασης ακτίνων Χ και φασματοσκοπίας μέσου υπερύθρου (FT-IR), η μικροδομή και η υφή (πορώδες) της πορώδους μεμβράνης, οι θερμικές ιδιότητες, η ρόφηση σε υγρό περιβάλλον (PBS και νερό) στους 37°C, και οι μηχανικές ιδιότητες, οι οποίες μετρήθηκαν με πειράματα αντοχής σε εφελκυσμό σε ξηρό και υγρό περιβάλλον, καθώς και μετά από παραμονή της μεμβράνης σε πλάσμα αίματος και PBS στους 37^ για την εκτίμηση της υποβάθμισης των μηχανικών ιδιοτήτων σε φυσιολογικό περιβάλλον με το χρόνο, και με μετρήσεις δυναμικής μηχανικής ανάλυσης (DMA) σε ξηρό και υγρό περιβάλλον για τον προσδιορισμό του μέτρου αποθήκευσης (Ε’) και του συντελεστή απόσβεσης (tanδ). Οι ιδιότητες αυτές μετρήθηκαν με σκοπό να αξιολογηθεί κατά πόσο η μεμβράνη προσεγγίζει τις ιδιότητες του καρδιακού ιστού. Πράγματι, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι φυσικοχημικές ιδιότητες και η μικροδομή επιτρέπουν τη θεώρηση της μεμβράνης ως υποψήφιας για χρήση στη συγκεκριμένη εφαρμογή, οι δε τιμές των μηχανικών ιδιοτήτων προσεγγίζουν αρκετά ικανοποιητικά της τιμές του ιστού του μυοκαρδίου.
Στη συνέχεια, με βάση τις ιδιότητες που προσδιορίστηκαν, έγινε μελέτη της διεπιφάνειας μεταξύ της μεμβράνης και κυττάρων ή καρδιακού ιστού. Στην αρχή διεξήχθη βιολογικός in vitro έλεγχος με κυτταροκαλλιέργειες ινοβλαστών (NIH3T3), ο οποίος έδειξε την επιβίωση και την ανάπτυξη των κυττάρων αυτών στη μεμβράνη χιτοζάνης, υποδεικνύοντας τη βιοσυμβατότητα της μεμβράνης που κατασκευάστηκε. Ακολούθησε ο in vivo έλεγχος με εμφύτευση της μεμβράνης επικαρδιακά σε φυσιολογικούς επίμυες τύπου Wistar, ο οποίος έδειξε ότι o χειρουργός μπορεί εύκολα και αξιόπιστα να χειριστεί τη μεμβράνη στο χειρουργείο, η οποία τοποθετείται με ακρίβεια γύρω από την καρδιά και παραμένει σταθερή στη θέση της καθ’ όλη την περίοδο της εμφύτευσης (30 ημέρες), δεν προκαλεί προβλήματα ή θάνατο στα ζώα και δίνει ενδείξεις αποικοδόμησης. Μετά την ευθανασία των ζώων, η μελέτη αντίδρασης ξένου σώματος κατέγραψε την καλύτερη δυνατή εξέλιξη ως απόκριση του εμφυτευόμενου υλικού, όπου καταγράφτηκαν σημαντική μείωση των φλεγμονωδών στοιρείων και εμφανής αύξηση νέων αγγείων σε ένα ραλαρό υπόστρωμα που προσομοιάζει αυτό της φυσιολογικής υποεπικαρδιακής στοιβάδας.
Το επόμενο βήμα ήταν η μελέτη της ρημείας της διεπιφάνειας μεταξύ της μεμβράνης και του ιστού του μυοκαρδίου μετά από αλληλεπίδραση (δηλαδή εμφύτευση) 2 και 7 ημερών. Ελήφθη ο ιστός της καρδιάς «τυλιγμένος» με τη μεμβράνη, από τα ζώα και ακολούθησε ο διαρωρισμός της διεπιφάνειας τους. Η μελέτη των επιφανειών μετά το διαρωρισμό, έγινε πειραματικά με ρρήση φασματοσκοπίας υπερύθρου (FT-IR) και φασματοσκοπίας φωτοηλεκτρονίων ακτίνων Χ (XPS), καθώς και υπολογιστικά, ρρησιμοποιώντας τη θεωρία συναρτησιακών της ηλεκτρονιακής πυκνότητας (DFT), σύμφωνα με τη μέθοδο B3LYP/6-31G. Αμφότερα τα πειραματικά και τα θεωρητικά αποτελέσματα έδειξαν την ισρυρή αλληλεπίδραση μεταξύ μεμβράνης και ιστού, η οποία οφείλεται στην ανάπτυξη ιοντικών δεσμών και δεσμών υδρογόνου.
Τέλος, με τη ρρήση υπολογιστικής μοντελοποίησης αναπτύρθηκε ένα ρεαλιστικό μοντέλο προσομοίωσης της ανθρώπινης καρδιάς και έγινε εκτίμηση της επίδρασης της μεμβράνης που παρασκευάστηκε, στα μεγέθη της τοιρωματικής τάσης, της παραμόρφωσης και της μετατόπισης, στην περίπτωση της πνευμονικής υπέρτασης. Για την επίλυση του προβλήματος, πρώτα κατασκευάστηκε η τρισδιάστατη γεωμετρία της δεξιάς κοιλίας, ακολούθησε η διακριτοποίηση για το τοίρωμα και το ρευστό (αίμα), και τέλος ορίστηκαν οι συνοριακές συνθήκες και οι ιδιότητες του ρευστού και του τοιρώματος. Δοκιμάστηκαν διαφορετικά πάρη μεμβρανών (1, 2, 3 mm) και διαφορετικά μέτρα ελαστικότητας (0,3 - 0,7 MPa).
Η εργασία ολοκληρώνεται με τη συζήτηση, την παράθεση των συμπερασμάτων και με προτάσεις για μελλοντική έρευνα.
(EL)
initially leads to hypertrophy and ultimately to right heart failure or even death. Indeed, pulmonary arterial hypertension (PAH) is a lethal disease with high rates of mortality and morbidity. Also, if not diagnosed and treated promptly, then average survival is only 2.8 years. Nonetheless, prognosis and diagnosis is still determined by the hypertrophy and by the right ventricular dilation and dysfunction. There are three main therapeutic options for the treatment of pulmonary hypertension, pharmacological treatments, mechanical support of the right ventricle (using special devices), and the use of biomaterials and implants. Regarding the latter option, a thorough literature review shows that there is no scientific documentation reporting on implants developed for use in right ventricular myocardium after pulmonary hypertension. The presentstudy aims at covering this gap by proposing a Road Map for the development of biomaterials for implants that can be used to treat (prevent, treat) pulmonary hypertension. Thus, this investigation comprises two distinct stages. The first one concerns the selection, qualification and optimization of a biomaterial that can be a candidate for being used for this purpose. The second one highlights the development (in terms of biology, surgery practice and performance, microstructure, chemistry, and mechanics) of the interface and the interactions between the implant and the outer surface of the myocardium, where the membrane is placed, as a major issue for predicting and understanding the performance of a biomaterial in the treatment of the disease, following the appropriate medicalprotocol proposed by the surgeon as far as its application in the heart is concerned. In the light of the specific application in the present case and the level of the research undertaken in this study, the most suitable geometry of the biomaterial was selected to be that of a membrane. Then, eight qualification criteria were defined, which must satisfy a biomaterial in order to be selected as candidate for use in the treatment of the disease. These are (1) the ability to create a membrane, (2) the good quality of the membrane, (3) the flexibility in order to be able to wrap around the epicardial tissue, (4) the tuning ability to regulate the mechanical properties in order to approach those of the cardiac tissue, (5) the tuning ability to regulate the thickness, (6) neutral pH, (7) in vitro and in vivo biocompatibility, and (8) biodegradability within a specific period of time. A series of hydrogels were produced, starting with PEG (poly (ethylene glycol)) and its derivatives ofPEGSDA (PEG sebacate diacrylate) and OPF (oligo poly (ethylene glycol) fumarate), followed by hydrogels of natural polysaccharides based on alginic acid and chitosan. The hydrogels based on PEG and alginic acid did not meet the qualification criteria and were, therefore, rejected from further consideration and experimentation. However, chitosan hydrogels showed better behavior. Therefore, various preparation methods were tested in order to produce a membrane that meets the qualification criteria. The parameters tested were the molecular weight (medium and low molecular weight chitosan was used), the neutralization solution (NaOH, KOH, β-GP), and theneutralization procedure (immersion or drop wise). Any combination of these three factors affects the mechanism of hydrogel formation and therefore the quality of the final product. The membrane with the optimal properties was prepared by the gelation process, using NaOH solution as a neutralizing agent without solvent evaporation. The properties of this membrane, which met the selection criteria, were determined experimentally. The determination of the degree of deacetylation, of the structural features of the membrane, by using X-ray diffraction and infrared (FT-IR) spectroscopy, of the microstructure and the texture (porosity) of the membrane, of the thermal properties, the sorption ability in PBS and water at 37 ° C, and the mechanical properties, was experimentally carried out. The mechanical properties were measured by tensile strength experiments in dry and wet environment as well as after the membrane immersion in blood plasma and PBS at 37° C for estimating the degradation of mechanical properties in a physiological environment over time, and by dynamic mechanical analysis (DMA) measurements in a dry and wet environment, to determine the storage modulus (E ') and of the damping factor (tanδ). The above properties were measured in order to evaluate whether this membrane mimics the properties ofthe heart tissue. The results showed that the physicochemical properties and the microstructure allow the membrane to be regarded as a candidate for use in the particular application, while its mechanical properties are in good agreement with the values of the myocardial tissue. Then, the interface developed between the selected membrane and cells or cardiac tissue was studied. Invitro biological tests were performed in fibroblast cell culture (NIH3T3). The results showed evidence of viability and growth of fibroblasts in the chitosan membrane, suggesting the biocompatibility of the membrane. Then, in vivo tests, by implanting the membrane in Wistar rats, were conducted. The results showed that a surgeon can easily and reliably handle the membrane, the membrane was positioned accurately around the heart and remained firmly in place within the period of implantation (30 days), without causing any problems or death in animals. There was also evidence of degradation. After the animals euthanasia, the foreign body response recorded the bestpossible biological response to the implanted material, where a significant reduction in inflammatory and a prominent increase of newly formed vessels were recorded. Then, the chemistry of the interface between the membrane and the myocardial tissue after implantation of 2 and 7 days was studied. The heart tissue wrapped around with membrane was obtained from the animals and theinterface was separated. The detached surfaces were examined by infrared spectroscopy (FT-IR) and X-ray photoelectron spectroscopy (XPS). The experimental findings were interpreted with the aid of results calculated theoretically by using the density functional theory (DFT) according to the B3LYP / 6-31G method. Both experimental and theoretical results suggested a strong interaction between membrane and tissue, attributed to ionic and hydrogen bonds. Finally, computational modeling was performed by developing a realistic simulation model of the human heart, in order to evaluate the effect of the membrane prepared on wall stress, deformation, and displacement inthe case of pulmonary hypertension. Before solving the problem, the three-dimensional geometry of the right ventricle was first constructed, followed by creating fluid and solid mesh and finally by defining the boundary conditions and the properties of the fluid and solid ventricular wall. Various thicknesses of membranes (1, 2, 3 mm) and Young modulus (0.3 - 0.7 MPa) were tested. The work ends with a discussion, the conclusions, and proposals for future research.
(EN)
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων
