Σκοπό της διατριβής αποτελεί η ανάπτυξη ενζυμικά καταλυόμενων διεργασιών για τον στοχευμένο βιομετασχηματισμό φυσικών προϊόντων, με στόχο την αναβάθμιση των ιδιοτήτων τους. Τα νανοδομημένα υλικά με βάση τον άνθρακα διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στα πεδία της νανοβιοκατάλυσης και της ενζυμικής βιοτεχνολογίας. Οι ιδιαίτερες ιδιότητες που εμφανίζουν έχουν προσελκύσει το ερευνητικό ενδιαφέρον. Τα νανοϋλικά που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα νανοδομημένα υλικά ιεραρχημένου πορώδους άνθρακα (hierarchically porous carbon materials, HPCs) και οι κυβοειδείς πορώδεις άνθρακες (porous carbon cuboids, PCCs). Τα υλικά αυτά μελετήθηκαν ως φορείς για την ακινητοποίηση ενός οξειδωαναγωγικού ενζύμου, της λακάσης και δύο υδρολυτικών ενζύμων, της λιπάσης και της β-γλυκοσιδάσης. Χρησιμοποιήθηκαν στην απλή τους μορφή και μετά από χημική επεξεργασία, είτε για να αποκτήσουν λειτουργικές ομάδες, είτε για να αποκτήσουν μαγνητικές ιδιότητες. Η ακινητοποίηση των ενζύμων πραγματοποιήθηκε με δύο τρόπους, με απλή προσρόφηση ή με τη δημιουργία ομοιοπολικού δεσμού. Τέλος, χρησιμοποιήθηκαν διάφορες φασματοσκοπικές και μικροσκοπικές μέθοδοι, για τον χαρακτηρισμό των νανοβιοκαταλυτών ως προς τη δομή τους και την καταλυτική τους συμπεριφορά. Η χημεία της επιφάνειας των νανοϋλικών φάνηκε να παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στην αλληλεπίδραση τους με τις πρωτεΐνες, επηρεάζοντας τόσο το ποσοστό ακινητοποίησης όσο και την καταλυτική δραστικότητα των ακινητοποιημένων ενζύμων. Ομοίως, οι προσεγγίσεις ακινητοποίησης που χρησιμοποιήθηκαν, φάνηκε να επιδρούν στην καταλυτική δραστικότητα, καθώς και στη θερμική και λειτουργική σταθερότητα των ακινητοποιημένων ενζύμων. Οι νανοβιοκαταλύτες που αναπτύχθηκαν επέδειξαν υψηλή καταλυτική δραστικότητα και σταθερότητα. Αυτά τα νανοβιοκαταλυτικά συστήματα, χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια για την βιομετατροπή διάφορων φυσικών προϊόντων με σκοπό την βελτίωση της βιολογικής τους δράσης. Η ακινητοποιημένη λακάση χρησιμοποιήθηκε επιτυχώς για την τροποποίηση της τυροσόλης και της υδροξυτυροσόλης, δύο φαινολικές ενώσεις με ποικίλες βιολογικές δράσεις. Η τροποποίηση αυτή οδήγησε στη δημιουργία κυρίως διμερών παραγώγων, τα οποία εμφάνισαν βελτιωμένες βιολογικές δράσεις. Στη συνέχεια, οι ακινητοποιημένες β-γλυκοσιδάσες χρησιμοποιήθηκαν επιτυχώς για την παραγωγή υδροξυτυροσόλης από πρότυπη ένωση ελευρωπαΐνης, καθώς και για τον εμπλουτισμό εκχυλισμάτων φύλλων ελιάς σε υδροξυτυροσόλη. Τα εμπλουτισμένα εκχυλίσματα φύλλων ελιάς εμφάνισαν καλύτερη αντιοξειδωτική, αντιμικροβιακή και αντικαρκινική δράση. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε κλιμάκωση (Scale-up) της χημειοενζυμικής τροποποίησης των εκχυλισμάτων φύλλων ελιάς από 1 mg σε 20 g σε βιοαντιδραστήρες διαλείποντος έργου. Τέλος, αναπτύχθηκε ο ‘NMR-tube βιοαντιδραστήρας’, μία μέθοδος τριών σταδίων που έχει διεξαχθεί ολοκληρωτικά μέσα σε ένα σωλήνα NMR 5 mm. Αυτή η απλή μεθοδολογία επιτρέπει: α) την πρόβλεψη της ικανότητας ενός φυσικού προϊόντος να λειτουργήσει ως υπόστρωμα για συγκεκριμένα ένζυμα, β) την καταγραφή της εξέλιξης της αντίδρασης βιοτροποποίησης προϊόντος/ών σε πραγματικό χρόνο και γ) τον έλεγχο της αλληλεπίδρασης των προϊόντων με πρωτεΐνες στόχους φαρμακευτικού ενδιαφέροντος. Συμπερασματικά, τα νανοδομημένα υλικά με βάση τον άνθρακα αποτελούν αποτελεσματικούς φορείς ακινητοποίησης ενζύμων για τη δημιουργία ισχυρών βιοκαταλυτικών συστημάτων. Παράλληλα, η τροποποίηση φυσικών προϊόντων με βιοτεχνολογικά εργαλεία μπορεί να οδηγήσει στη σύνθεση ενώσεων με πλούσια βιολογική δράση. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής καταδεικνύουν τα πλεονεκτήματα που προκύπτουν από την εφαρμογή της νανοτεχνολογίας στην ανάπτυξη βιοκαταλυτικών συστημάτων, κατευθύνοντας την έρευνα προς τον τομέα της νανοβιοτεχνολογίας, έναν κλάδο που μπορεί να προσφέρει μία πληθώρα νέων και εναλλακτικών εφαρμογών.
(EL)
The current PhD thesis aims at developing enzyme-catalyzed processes for the targeted biotransformation of natural products with the purpose to improve their properties. Carbon-based nanostructured materials play an important role in the fields of nanobiocatalysis and enzyme biotechnology. Their special properties have attracted considerable research interest. In this study, nanostructured hierarchically porous carbon materials (HPCs) and porous carbon cuboids (PCCs) were employed. These types of nanomaterials were used as carriers for the immobilization of different enzymes - laccase, an oxidoreductase and two hydrolases, namely lipase and β-glucosidase. The nanomaterials used were either in their bare form or chemically modified, in order to obtain functional groups or to gain magnetic properties. Enzyme immobilization was carried out in two methods – by adsorption or by covalent linkage. Finally, different spectroscopic and microscopic techniques were employed for the nanobiocatalysts characterization in terms of their structure and catalytic behavior. Surface chemistry of nanomaterials is of fundamental importance regarding their interaction with biomolecules, affecting both immobilization yield and catalytic activity of immobilized enzymes. Similarly, the immobilization techniques that were utilized seem to affect the catalytic activity, as well as the thermal and operational stability of the immobilized enzymes. The developed nanobiocatalysts exhibited remarkable catalytic activity and stability. The nanobiocatalytic systems developed under the scope of the present thesis were subsequently utilized for the biotransformation of various natural products aiming at the improvement of their biological activity. Immobilized laccase was successively used for the modification of tyrosol and hydroxytyrosol, two phenolic compounds with various biological activities. The modification process led mainly to dimeric derivatives, which demonstrated increased biological activities. Following, the immobilized β-glucosidases were successfully employed for the production of hydroxytyrosol from the standard oleuropein compound, while they were also applied for the enrichment of olive leaves extracts in hydroxytyrosol with the purpose to improve their biological activity. The hydroxytyrosol enriched olive leaves extracts demonstrated improved antioxidant, antimicrobial and anticancer activity. Furthermore, scale-up of the chemoenzymatic modification process was carried out, moving from 1 mg to 20 g by using batch bioreactor systems. Lastly, an “NMR-tube bioreactor” system was developed, as a three-step method carried out entirely in a 5 mm NMR tube. This simple procedure enables: a) the prediction of the ability of a natural product or a mixture of products to perform as a substrate for particular enzymes, b) the real time monitoring of the biotransformation, and d) the investigation of interaction of different products with a target protein of pharmaceutical interest. As a conclusion, carbon-based nanostructured materials consist efficient carriers for enzyme immobilization, leading to the formation of robust biocatalytic systems. On the other hand, modification of natural compounds with biotechnology tools is a much promising guideline for the synthesis of compounds with enriched biological activity. The results of the present thesis indicate the benefits which arise from the incorporation of nanotechnology in the development of biocatalytic systems, directing the research to the field of nanobiotechnology, with a plethora of new and alternative applications.
(EN)
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων
